فحص الديناميات النووية الخميرة الانشطارية الميتومية وMeiotic عن طريق الفلورة الخلية الحية المجهرية
Summary
هنا، نقدم التصوير بالخلايا الحية وهو طريقة مجهرية غير سامة تسمح للباحثين بدراسة سلوك البروتين والديناميات النووية في خلايا الخميرة الانشطارية الحية أثناء الداء الميتوميوميس.
Abstract
التصوير بالخلايا الحية هو تقنية مجهرية تستخدم لفحص ديناميات الخلايا والبروتين في الخلايا الحية. هذه الطريقة التصوير ليست سامة، عموما لا تتداخل مع فسيولوجيا الخلية، ويتطلب الحد الأدنى من المناولة التجريبية. المستويات المنخفضة من التداخل التقني تمكن الباحثين من دراسة الخلايا عبر دورات متعددة من الداء الميتوميوتلاحظ من البداية إلى النهاية. باستخدام علامات الفلورسنت مثل بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) وبروتين الفلورسنت الأحمر (RFP)، يمكن للباحثين تحليل العوامل المختلفة التي تكون وظائفها مهمة لعمليات مثل النسخ، وتكرار الحمض النووي، والتماسك، والفصل العنصري. جنبا إلى جنب مع تحليل البيانات باستخدام فيجي (نسخة مجانية والأمثل ImageJ)، يقدم التصوير بالخلايا الحية طرق مختلفة لتقييم حركة البروتين، والتوطين، والاستقرار، والتوقيت، فضلا عن الديناميات النووية والفصل الكروموسومي. ومع ذلك، كما هو الحال مع أساليب الفحص المجهري الأخرى، يقتصر التصوير بالخلايا الحية بالخصائص الجوهرية للضوء، والتي تضع حداً لقوة الدقة عند التكبير العالي، كما أنها حساسة لتبييض الصور الضوئية أو السمية الضوئية على طول موجة عالية الترددات. ومع ذلك، مع بعض العناية، يمكن للمحققين تجاوز هذه القيود المادية عن طريق اختيار بعناية الظروف الصحيحة، وسلالات، وعلامات الفلورسنت للسماح للتصور المناسب للأحداث mitotic وmeiotic.
Introduction
يسمح الفحص المجهري للخلايا الحية للباحثين بفحص الديناميات النووية دون قتل خلايا الخميرة الانشطارية ويزيل الحاجة إلى المثبتات والبقع القاتلة. من الممكن ملاحظة استقرار وحركة وتوطين وتوقيت البروتينات ذات العلامات الفلورية التي تشارك في أحداث هامة مثل النسخ المتماثل للكروموسوم، وإعادة التركيب، والفصل، بالإضافة إلى الغشاء والخلايا الهيكلية الحركات. من خلال الحفاظ على صلاحية الخلية والكشف عن إشارة غير سامة، هناك الحد الأدنى من التسلل الفسيولوجية. عند تنفيذها بشكل صحيح، يمكن أن تقلل هذه الطريقة المجهرية من الآثار المربكة التي تنشأ عن المعالجة التقنية الموسعة أو من التفاعل الكيميائي الهامشي. وعلاوة على ذلك، خلال تجربة، يمكن للباحثين جعل الملاحظات ذات الصلة من خميرة الانشطار التغذية وحالات الإجهاد، وكفاءة التكاثر، والحالة المبرمجة التي تشير إلى معلمات التصوير غير المناسب أو علم وظائف الأعضاء الخلية غير طبيعية1 ،2،3.
يتميز الانقسام النووي والخلوي بالانقسام المنوّع والانقسام. في meiosis ، على عكس الداء الميتومي ، يتم خفض المحتوى الجيني إلى النصف حيث أن الخلايا الأم تؤدي إلى خلايا الابنة4. نظرًا لأن التصوير بالخلايا الحية يوفر بعدًا زمنيًا بالإضافة إلى العلاقة المكانية، يمكن فحص أعداد كبيرة من الخلايا في الوقت الحقيقي. وقد مكنت مجهرية الخلية الحية الباحثين لدراسة ديناميات التقسيمالنووي باستخدام علامات الفلورسنت للهيستون5 , cohesin الوحدات الفرعية6, microtubules7, centromeres8, kinetochores9, مكونات جسم القطب المغزل (SPB)10، وتلك من مجمع الركاب كروموسوم (CPC)11. خارج جهاز فصل الكروموسوم، التقط التصوير بالخلايا الحية أيضًا سلوك البروتينات الضرورية، ولكن لم يشارك مباشرة في فصل الكروموسومات. وقد ثبت أن وظيفة هذه البروتينات تؤثر على النسخ المتماثل، وإعادة تركيب الكروموسوم، والحركة النووية، وارتباط الكروموسوم بالأنابيب الدقيقة12،13،14. وقد أسهمت هذه الملاحظات في تحسين فهم الأحداث الخلوية التي لم تكن مكوناتها الوظيفية قابلة للفحص البيوكيميائي أو الجيني. مع التقدم الجديد في تكنولوجيا الفحص المجهري، سوف تنخفض القيود مثل ضعف الدقة، وتبييض الصور، والسمية الضوئية، والاستقرار التركيز، وبالتالي تسهيل أفضل في الوقت الحقيقي ملاحظات الديناميات النووية mitotic وmeiotic1، 2،3. Meiosis هو التحدي بشكل خاص لأنه مسار التمايز النهائي الذي يتطلب اهتماما وثيقا بالتوقيت.
والهدف من هذا البروتوكول هو تقديم طريقة بسيطة نسبيا لدراسة الديناميات النووية الخميرة الانشطارية في الوقت الحقيقي في الداء الميتوميوية وmeiosis. لتحقيق ذلك، من الضروري استخدام الخلايا التي لم تتعرض للإجهاد البيئي، وإعداد منصات أجاروز التي يمكن أن تصمد أمام التصوير لفترات طويلة، وجبل الخلايا في الكثافات التي تسهل تصور ديناميات خلية واحدة. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول يستخدم الخلايا التي تحمل بروتينات ذات علامات فلورية تعمل كعلامات مفيدة للحركية النووية (Hht1-mRFP أو Hht1-GFP)، والفصل الكروموسومي (Sad1-DsRed)، وديناميات الهيكل الخلوي (Atb2-mRFP)، والنسخ التنشيط في G1 / S (Tos4-GFP)، والاستقرار التماسك في meiosis (Rec8-GFP). كما تقدم هذه الطريقة علامات نووية ودورية إضافية (الجدولالأول)التي يمكن استخدامها في مجموعات مختلفة لمعالجة الأسئلة حول عمليات خلوية محددة. وعلاوة على ذلك، تُظهر أدوات فيجي الأساسية لمساعدة الباحثين على معالجة صور الخلايا الحية وتحليل أنواع مختلفة من البيانات. وتنبع قوة هذا النهج من استخدام الملاحظات في الوقت الحقيقي لديناميات البروتين، والتوقيت، والاستقرار لوصف العمليات التي هي جزء لا يتجزأ من التنفيذ السليم للميثوسيس وداء الميوسيس.
Protocol
1- إعداد وسائل الإعلام15و16 حلول الأسهم إعداد محلول مخزون الملح 50X عن طريق إضافة 52.5 غرام من MgCl2·6H20, 0.735 غرام من CaCl2·2H20, 50 غرام من KCl, و 2 غرام من Na2S04 في زجاجة تحتوي على 1 لتر من الماء المقطر. خلط الحل جيدا وتعقيم عن طريق الترشيح. ضعها عند درجة حرارة 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. جعل 1000x فيتامين الأوراق المالية الحل عن طريق خلط 1 غرام من حمض البانتوثينيك، 10 غرام من حمض النيكوتينيك، 10 غرام من الإينوزيتول، و 10 ملغ من البيوتين في زجاجة تحتوي على 1 لتر من الماء المقطر. خلط الحل جيدا وتعقيم عن طريق الترشيح. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية للتخزين على المدى الطويل. إعداد 10،000X حل الأوراق المعدنية عن طريق إضافة 5غرام من حمض البوريك، 4 غرام من MnSO 4، 4 غرام من ZnSO4·7H2O، 2 غرام من FeCl2·6H2O، 1 غرام من KI، 0.4 غرام من حمض الموليبديك، 0.4 غرام من النحاس البورى ·4 5H20 ، و 10 غرام من حامض الستريك في زجاجة تحتوي على 1 لتر من الماء المقطر. خلط الحل جيدا وتعقيم عن طريق الترشيح. ضعها عند درجة حرارة 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. جعل الحلول الفردية مخزون المواد الغذائية عن طريق إضافة 7.5 غرام من الأدينين، ليوسين، الهيستيدين أو يسين في زجاجة تحتوي على 1 لتر من الماء المقطر. استخدم 3.75 غرام فقط لصنع محلول الأوراسيل. تعقيم الحلول عن طريق الأوتوكلاف.ملاحظة: مع مرور الوقت، uracil يعجل من الحل. لجلب في الحل مرة أخرى، دافئة في الميكروويف في 60٪ السلطة في 10 ثانية الزيادات أو مكان في حمام مائي 55 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الخميرة استخراج بالإضافة إلى المكملات الغذائية (نعم) في قارورة 2 لتر، إضافة 1 لتر من الماء المقطر، 5 غرام من قاعدة استخراج الخميرة، 30 غرام من الجلوكوز، و 225 ملغ كل من الأدينين، أوراسيل، L-الهيستيدين، L-ليوسين، و L-يسين. أضف 20 غ من أجار لجعل الوسط الصلب. استخدام شريط ضجة المغناطيسي لإذابة تماما المكونات في الحل. سوف يذوب أجار بعد تعقيم الوسيط عن طريق الأوتوكلاف.ملاحظة: وللراحة، يتوفر مسحوق YES جاهز للاستخدام أيضًا تجاريًا. إدنبرة الحد الأدنى المتوسط (EMM) وبومبي غلوتامات المتوسطة (PMG) في قارورة 2 لتر، الجمع بين 1 لتر من الماء المقطر مع 3 غرام من الفثالات الهيدروجين البوتاسيوم، 2.2 غرام من Na2HPO4،5 غرام من NH4Cl، 20 غرام من الجلوكوز، 20 مل من محلول مخزون الملح، 1 مل من محلول مخزون فيتامين ، و 0.1 مل من محلول الأوراق المعدنية. استبدال NH4Cl مع 2.2 غرام من ملح أحادي الصوديوم حمض L-الجلوتاميك لإعداد PMG. لجعل المتوسطة الصلبة، إضافة 20 غرام من أجار. باستخدام شريط تحريك مغناطيسي، حل المكونات جيدا. سوف يذوب أجار بعد تعقيم الوسيط عن طريق الأوتوكلاف. قبل الاستخدام، أضف حلول مخزون المغذيات حسب الضرورة. لكل 1 لتر من المتوسط، إضافة 15 مل كل من الأدينين، ليوسين، الهيستيدين، وليسين. استخدام 30 مل لuracil، لأنها أقل تركيزا من الحلول المغذية الأخرى.ملاحظة: وللراحة، تتوفر مساحيق EMM وPMG الجاهزة للاستخدام بشكل تجاري. استخراج الشعير (ME) استخدام قارورة 2 لتر لخلط 1 لتر من الماء المقطر مع 30 غرام من استخراج الشعير و 225 ملغ كل من الادينين، uracil، الهيستيدين، وليوسين. ضبط الوظيفة الهيدروجينية إلى 5.5. وتشمل 20 غرام من أجار لجعل المتوسطة الصلبة. حل المكونات في الحل باستخدام شريط ضجة المغناطيسي. سوف يذوب أجار بعد تعقيم الوسيط عن طريق الأوتوكلاف. أجار سبورليشن مع المكملات الغذائية (SPAS) في قارورة 2 لتر، إضافة 1 لتر من الماء المقطر، 10 غرام من الجلوكوز، 1 غرام من KH2PO4،1 مل من مخزون فيتامين، 45 ملغ كل من الأدينين، أوراسيل، هيستيدين، ليوسين، وهيدروكلوريد يسين. أضف 20 غ من أجار لجعل الوسط الصلب. استخدم شريط تحريك مغناطيسي للجمع بين المكونات. سوف يذوب أجار بعد تعقيم الوسيط عن طريق الأوتوكلاف. 2- ثقافة الخميرة الانشطارية15و16 استخدام نعم المتوسطة الصلبة لإيقاظ سلالات الخميرة الانشطارية من الحفاظ على المبردة. اعتمادا على متطلبات درجة الحرارة لكل سلالة، وحضانة في 25 درجة مئوية أو 32 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام. عندما تكون المستعمرات مرئية، وإعداد ثقافة السائل كاتب. اختيار الخلايا من المستعمرات الفردية وتلقيحها في أنابيب الاختبار التي تحتوي على 3 مل نعم السائل المتوسط. تنمو في درجة الحرارة المناسبة إلى منتصف أو في وقت متأخر من مرحلة السجل.ملاحظة: للتبذير السليم، استخدم أنابيب أو قوارير مع أحجام لا تقل عن 5x أكبر من حجم الثقافة السائلة المقصود. سرعة الاهتزاز بين 150-220 دورة في الدقيقة هي المعتادة لنمو الثقافة الروتينية. الاستغناء عن 250-500 درجة مئوية من ثقافة كاتب في قارورة 50 مل تحتوي على 9.5-9.75 مل إما نعم، EMM أو PMG بالإضافة إلى المكملات الغذائية المناسبة. السماح للخلايا بالنمو إلى الكثافة المطلوبة والتحقق تحت المجهر لمورفولوجيا الخلية المناسبة والحالة الغذائية.ملاحظة: لتخزين سلالات استيقظ لمدة تصل إلى شهر، ختم لوحات YES مع شريط البارافين ووضعها في 4 درجة مئوية. 3. إعداد عينة2 إعداد الشريحة المجهر إضافة 2 غرام أغاروز في كوب 500 مل يحتوي على 100 مل من الحد الأدنى من المكملات الغذائية المتوسطة بالإضافة إلى (ميتوسيس) أو SPAS السائل (meiosis). قم بتسخين محلول الأجاروز في فرن ميكروويف بقوة 60% بزيادات 10 ثوانٍ أو ضعها في حمام مائي بزاوية 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إعداد agarose الشريحة صنع الإعداد (الشكل1A)لضمان إعداد لوحة سريعة ومنع الأغروز المنصهر من ترسيخ قبل الأوان. السماح للأجاروز المنصهر لتبرد لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والاستغناء عن بقع 50-100 درجة مئوية على الشرائح المجهر باستخدام نصائح ماصة واسعة تتحمل. قبل أن يبرد الأغروس، ضع شريحة مجهر على الجزء العلوي لتوليد لوحة انتشار من حوالي 1.5-2 سم في القطر (الشكل1B-C). عادة ما يتناسب عرض لوحة الأجاروز مع طول وقت التصوير. وبعبارة أخرى، منصات أكثر سمكا تحمل فترات التصوير أطول. استخدم خليط الهيدروكربوني كمانع للتسرب لضمان التغطية المناسبة للشرائح ذات الفوط السميكة من الأجاروز ومنع موت الخلايا من التعرض للالمذيبات عند حواف غطاء الغلاف. مزيج أجزاء متساوية (ث / ث) من هلام النفط، اللانولين، والبارافين في كوب 500 مل. تُسخّن المكوّنات على طبق ساخن عند درجة حرارة 120 درجة مئوية لمدّة 5 دقائق. كما تذوب المكونات، دوامة بعناية الحل المنصهر لضمان الخلط المناسب. نموذج الإعداد لفحص الأحداث الميتوتيك، تنمو الخلايا من الثقافات كاتب إما في EMM السائل أو PMG بالإضافة إلى المكملات الغذائية إلى مرحلة منتصف السجل تقريبا (OD595 من 0.4). الطرد المركزي 1 مل من تعليق الخلية في 1,375 × ز لمدة 1 دقيقة, إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في الحد الأدنى من المتوسطة بالإضافة إلى المكملات الغذائية إلى حجم نهائي من 100 درجة مئوية. لتصوير الأحداث meiotic، تنمو الخلايا من الثقافات كاتب في الحد الأدنى من المتوسطة بالإضافة إلى المكملات الغذائية إلى مرحلة سجل في وقت متأخر (OD595 من 0.7-1.0). الجمع بين أحجام متساوية من الخلايا المقابلة من نوع زميله (ح- و ح+) في تعليق خلية 1 مل. خلايا الطرد المركزي في 1375 × ز لمدة 1 دقيقة وإعادة تعليق بيليه في السائل ME. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات لضمان إزالة المغذيات بكفاءة. بعد غسل ME الماضي، إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من ME وإضافته إلى قارورة 50 مل تحتوي على 9 مل ME. حضانة ل12-16 ساعة في 22-25 درجة مئوية على الحد الأدنى من سرعة الدوران (50-100 دورة في الدقيقة). اللف الخلية وفيرة، مما يؤدي إلى العديد من كتل الخميرة الانشطار جولة ويشير إلى كفاءة التزاوج. خذ عينة 1 مل من ثقافة التزاوج والطرد المركزي في 1375 × ز لمدة دقيقة واحدة. قبل وضع الخلايا على منصات أغاروز، دوامة بقوة لمدة 5 s لتعطيل كتل.ملاحظة: أما الـ 250 ميكرولتر ME المتبقية المستخدمة لإعادة تعليق الخلايا فتحتوي على عوامل تزاوج تساعد الخلايا على دخول الداء النيهوسي. ضع 20 ميكرولتر إما تعليق خلية ميتوتيك أو ميوتيك على وسادة أغاروز 2%. إزالة أي وسيلة زائدة عن طريق عكس الشريحة ووضعها على الجزء العلوي من منشفة ورقية خالية من الوبر لمدة 2-3 ق (الشكل1D). تعيين الشريحة وسادة الجانب صعودا ووضع بلطف غطاء زجاجي، وضمان عدم توليد فقاعات الهواء (الشكل1F).ملاحظة: القضاء على المتوسطة الزائدة مع منشفة ورقية هو أكثر كفاءة من الوقت من امتصاص الجاذبية، وهو أمر بالغ الأهمية في تجارب meiosis. لإنشاء خلية أحادية الطبقة، قم بتدوير غطاء الانزلاق في اتجاه عقارب الساعة مع السبابة لواحد (الداء الميتومي) أو اثنين (meiosis) المنعطفات الكاملة (الشكل1F). تأكد من أن المادة الخلية يتفرق عبر لوحة أغاروز مما يسمح لفصل أفضل من الخلايا واحدة أو asci. مع المعونة من عصا خشبية صغيرة، الاستغناء عن مانع التسرب المنصهر على طول حواف غطاء لختم كل لوحة أغاروز (الشكل1G). بمجرد أن يتم إغلاق وسادة أغاروز، ووضعها على مرحلة المجهر والسماح لها بالتوازن لمدة 10-15 دقيقة في ظروف التصوير المناسبة (على سبيل المثال، درجة الحرارة) (الشكل1H)للسماح فقاعات الهواء لتبديد والسماح لأي تحولات أجاروز في اللحظة الأخيرة أن تحدث. ابدأ التصوير بمجرد أن يتم معادلة الشريحة بكفاءة ولا تقم بإزالتها من المرحلة حتى ينتهي جمع البيانات.ملاحظة: يتم تحديد التحكم في درجة الحرارة والرطوبة من قبل نظام المجهر المستخدمة ومتطلبات تجريبية محددة. إذا كان موجودا، وتطبيق التحكم في درجة الحرارة والرطوبة لجميع تجارب التصوير. إذا كان غائبا، يجب على الباحثين ابتكار وسيلة لمنع تقلبات درجة الحرارة، وخاصة خلال تجارب داء الموهيوس. 4. التصوير بالخلايا الحية2 والمعالجة استخدم هدف 40x للعثور على حقول العرض المناسبة للصورة. انتقل إلى هدف 60x لبدء الحصول على البيانات. اعتمادا على نظام المجهر المستخدمة، وإعادة التركيز اللاحقة والقسم على العينة في كل نقطة زمنية سوف تحدث يدويا أو من خلال عملية المجهر أو البرمجيات الآلي.ملاحظة: تم جمع الصور المعروضة في هذا البروتوكول باستخدام deconvolution، مجهر الفلورة مجهزة Sedat، RFP ومجموعات تصفية GFP، مرحلة نانو الحركة، 60X NA 1.4 عدسة موضوعية، وكاميرا CCD 12 بت. يسمح مصاريع ميكانيكية مدمجة وعجلات تصفية آلية لتقليل التعرض للإثارة وتبييض الصور من العينات. استخدم البرامج المناسبة للحصول على الصور ومعالجتها. إلى الصور deconvolve، استخدم وظائف النقل البصري التي توفرها الشركة المصنعة.ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول معدات المجهر والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول، يرجى الرجوع إلى جدولالمواد. لاستخدام مجهر الفلورة التقليدي للحصول على صور الخلايا الحية ضمان أن المجهر يجمع البيانات رقميا، لديه 40x أو 60x الأهداف مع فتحات رقمية (NA) أكبر من 1.2، وقادرة على إجراء التجزذي البصري.ملاحظة: وبدون هذه المتطلبات، ستظهر الصور دقة أقل، مما يعرض للخطر نوعية القياسات المجهرية والملاحظات النوعية. استخدام برامج المكونات الإضافية المجانية (مثل فيجي) لتقليل أخطاء التمويه المنهجية الناجمة عن فقدان التباين أثناء الحصول علىالصورة17و18و19و20 وضمان التحليل الكمي المناسب من شدة الفلورة وغيرها من الأحداث الزمنية والدينامية داخل الخلية.ملاحظة: ويمكن الاطلاع على برامج أخرى متاحة للdeconvolution التجارية في جدول المواد. اختيار مجموعات مرشح المجهر التي تتطابق على أفضل وجه الفلوروفور تحت الملاحظة. تأكد من أن مرشحات الإثارة والانبعاثات لديها تمريرات النطاق الصحيح التي تسمح للكشف محددة من البروتينات الفلورية. فعلى سبيل المثال، للكشف عن إشارة سي اف بي، من المناسب الحصول على إشارة من نوع الإثارة والانبعاثات من 430/25 و470/30، ولكن ليس لفلورة طلب تقديم العروض. استخدم نهج إعدادات الحد الأدنى الفعال (MESA) عند تصوير الخميرة الانشطارية في نقاط زمنية متعددة. وبعبارة أخرى، تجنب الاستخدام المطول لموجات الإثارة واستخدم أقل قوة إثارة ووقت التعرض التي تولد بيانات التصوير المقبولة، ولكن القابلة للقياس الكمي والقابلة للاستنساخ. للتصوير لفترات طويلة أثناء الداء اللمطي أو الداء اللامعي، حدد الفاصل الزمني بين نقاط وقت الاكتساب إلى 5-10 دقائق. على الرغم من أن 2٪ منصات أغاروز يمكن أن تصمد أمام 12 إلى 16 ساعة جلسات التصوير، والخلايا التحول بسبب تبخر الأجاروز من المرجح. لذلك، إجراء تجارب الداء الميكوني الكامل أو الداء المأسوف في نوافذ 4-6 ساعة أو 8-10 ساعة، على التوالي. جمع بيانات التصوير لمدة 4-8 ساعة تتكون من ما لا يقل عن 24-48 نقطة وقت الاكتساب، على التوالي، بروتين الفلورة واحد، وz-كومة لكل نقطة زمنية وقناة الفلورسنت تتألف من 13 أقسام مع تباعد 0.5-ميكرومتر باستخدام هدف 60x. يتطلب هذا 0.5-1 غيغابايت على الأقل من مساحة تخزين محرك الأقراص الثابتة. وهكذا، إلى جانب القضاء على تبييض الصور وتحويل الخلايا،إنشاء سير العمل الذي يأخذ في الاعتبار قدرات الحوسبة 1،2،3.ملاحظة: عادة ما يتم تعيين معلمات الاكتساب هذه وتعديلها في البرنامج الذي يتحكم في وظائف المجهر والذي يجمع الصور ويعالجها. لدراسة عمليات نووية محددة بمزيد من التفصيل، إجراء الحصول على الصور كل 5-10 ثوان، طالما أن الانبعاثات لا تنخفض بشكل كبير بعد التعرض المتكرر. إجراء تحليل أولي لشدة الفلورة على مدى فترات زمنية مختلفة لتحديد النقطة التيبعدها لم تعد دقة البيانات التي تم جمعها موثوقة 1،3. في برنامج الحصول على الصور ومعالجة الصور، استخدم الإسقاط الكثافة القصوى على مكدسات z الصورة لمراقبة جميع الهياكل ذات الكثافة الفلورية العالية على مستوى ثنائي الأبعاد بغض النظر عن موقعها الرأسي1،2، 3. وهذا ييسر الفحص السريع للعمليات النووية التي تحدث في مختلف المجالات. جمع صورة المجال الساطع منتصف التركيز لتوليد صورة مرجعية للخلايا تحت الملاحظة. 5. تحليل الصور20،21 ملاحظة: يتم إجراء تحليل الصورة في هذا البروتوكول باستخدام فيجي. رأيت لأخرى تحليل برنامج وفيجي [إينّس] جدول ال [متريلس]. تحميل صورة deconvolved عن طريق تحديد ميزة المستورد الأشكال الحيوية ضمن القائمة الإضافات. في الإطار المنبثق خيارات الاستيراد، حدد Hyperstack، وضع اللون الافتراضي، وتحقق من المقياس التلقائي قبل الضغط على الزر موافق . تأكد من أن الإطار المعروض يحتوي على العدد الصحيح من قنوات الفلورة والأطر الزمنية عن طريق التمرير جانبية على الأشرطة المعنية في الجزء السفلي. حفظ كملف Tiff الذي لا ضغط البيانات ويمنع فقدان المعلومات. افتح صورة تحتوي على شريط مقياس تم إنشاؤه أثناء معالجة البيانات بواسطة برنامج المجهر. حدد طول بكسل شريط المقياس باستخدام أداة الخط المستقيم لرسم خط متوازي من حجم مماثل وحدد قياس من القائمة تحليل. أضف شريط مقياس عن طريق تعيين نسبة البكسل إلى البكسل للصورة عن طريق تحديد تعيين مقياس من القائمة تحليل. في الإطار المنبثق “تعيين مقياس” ، أدخل المسافة المحسوبة بالبكسل والمسافة المعروفة بالبكسل ،قم بتعيين نسبة العرض إلى ارتفاع البكسل إلى 1.0 ، ووضع ميكرون كوحدة طول، وحدد المربع العمومي قبل النقر فوق حسناً، الزر استخدم الخيار تعيين قياسات ضمن القائمة تحليل لاختيار معلمات مختلفة لتحديد كميتعند تحديد القياس. لأغراض هذا البروتوكول، حدد المقاييس التالية: المساحة، المحيط، متوسط القيمةالرمادية، متوسط،الحد الأدنى والحد الأقصى للقيمةالرمادية، الكثافة المتكاملة،موضع المكدس، والعرض التسمية. اعتماداً على دقة البيانات التي تم جمعها، أدخل أكثر من 1 لخيار المنازل العشرية وتحقق من مربع التدوين العلمي إذا لزم الأمر. بعد تطبيق الأمر قياس، سوف يظهر إطار النتائج المنبثقة القيم لكل معلمة ذات صلة. حفظ النتائج كملف .csv للتحليل المستقبلي في برنامج إحصاءات.ملاحظة: ليس من الضروري فصل صورة في قنوات الفلورسنت المكونة لها لتحديد الطول، ما لم يكن هناك تداخل إشارة بين الألوان المختلفة في هذه الحالة اتبع الخطوة المفصلة أدناه. في حالة تداخل الإشارة، حدد أداة الألوان والقنوات من قائمة الصور وقم بتحليل كل لون بشكل منفصل. لقياس طول البنيات غير الخطية، انقر بزر الماوس الأيمن فوق “أداة الخط” واستخدم الخيار خط مجزأ أو خط حر لتتبع الكائنات المطلوبة. بالنسبة للبنيات الخطية أو لتحديد المسافة بين نقطتين، استخدم ميزة الخط المستقيم وحدد قياس من القائمة تحليل. سيتم إضافة قيم الطول بالـ μm تلقائيًا إلى المعلمات المحددة مسبقًا ضمن الخيار تعيين القياسات. لقياس التغيرات في حجم الإشارة وكثافة الفلورة، أولاإنشاء منطقة الاهتمام (ROI) مكتبة، مما يزيد من دقة القياس الكمي ويسهل القياسات السريعة عبر كومة الصور. حدد أداة الألوان والقنوات ضمن القائمة صورة. في النافذة المنبثقة للقنوات، تحقق من قناة الألوان التي سيتم قياس الكثافة أو المنطقة لها. اختر ميزات ضبط وعتبة ضمن القائمة صورة. حدد مربع الخلفية المظلمة، وحدد الطريقة الافتراضية (ما لم تتطلب البيانات التي تم جمعها خلاف ذلك)، واختر Red لتراكب إشارات الاهتمام.ملاحظة: يعتمد قياس استقرار البروتين وحركته وتوطينه بشكل وثيق على عتبة اللون المستخدمة لإنشاء مكتبات عائد الاستثمار. من المهم اختيار طريقة العتبات الصحيحة لنوع إشارة علامة الفلورسنت ليتم تصورها17،18. استخدم أداة العصا لتسليط الضوء على كل بنية اهتمام واضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لإضافة عائد الاستثمار المحدد إلى نافذة مدير عائد الاستثمار المنبثقة. كرر هذه العملية لكل شريحة (الإطار الزمني) في مكدس الصور وتخزين كافة ROIs عن طريق النقر على الزر المزيد وتحديد حفظ. افتح مجلد عائد الاستثمار المضغوط لتحميل مدير عائد الاستثمار وانقر على كل معرف عائد الاستثمار على اللوحة الجانبية اليسرى. حدد قياس من القائمة تحليل وكرر هذا الأمر على كل معرف عائد استثمار لتحديد الكائنات ذات الأهمية في كافة شرائح مكدس الصور. إذا كان تحويل الخلية ليست مشكلة والمستوى البؤري لا يزال هو نفسه لجميع شرائح المكدس، انقر على قياس متعدد في مدير عائد الاستثمار. في النافذة المنبثقة، حدد قياس كافة الشرائح بدلاً من صف واحد لكل شريحة لتكرار القياسات عبر مكدس الصور. حفظ النتائج كملف csv وتحليل القياسات في برنامج إحصاءات. بالنسبة للإشارات النووية المتعددة التي تتألف من بنية الاهتمام، اضغط على مفتاح Shift أثناء تحديد الكائنات باستخدام أداة العصا لإنشاء عائد استثمار واحد. بدلا من ذلك، إنشاء عائد استثمار من حجم ثابت مع أداة البيضاوي لتشمل جميع إشارات الاهتمام.ملاحظة: قد يكون هذا النهج البيضاوي ضروريًا لقياس ووصف سلوك الإشارة فوق منطقة تتغير فيها إشارة الفلورة في الحجم والكثافة مع مرور الوقت. كثافة الإشارة، في هذه الحالة، هي متوسط كثافة الإشارة على منطقة معينة. تحديد التعريب المشترك لإشارات الفلورسنت من خلال التغير في لون منطقة تداخل الإشارة. ومع ذلك، مع تضييق منطقة التعريب المشترك، يكون من الأصعب التمييز بين تداخل الإشارة. في هذه الحالة، اتبع الخطوات المفصلة أدناه. باستخدام “أداة القنوات”، كما هو موضح في الخطوة 5.6، رسم خط مستقيم فوق كل إشارة في السؤال، وحدد الأمر “ملف تعريف الرسم” ضمن القائمة تحليل. كرر هذه الخطوة لكافة الألوان المعنية باستخدام نفس السطر المرسوم. في رسم نموذج النافذة المنبثقة التي تظهر بعد كل خطوة إنشاء تشكيل جانبي، اضغط على الزر قائمة لاستدعاء إطار قيم المؤامرة، وحفظ القياسات لكل إشارة كملف csv. في برنامج إحصائيات، قم بإنشاء رسم بياني يرسم القيمة الرمادية لكل إشارة مقابل موقعها المقابل (بالكم) على طول الخط المرسوم. ويشير عدم التداخل بين قطع خصائص الإشارة عموماً إلى عدم وجود توطين مشترك.ملاحظة: استخدم أداة ملف تعريف الرسم على الصور المتوقعة لفحص الترجمة المشتركة للإشارة. هذا يمكن الاعتماد عليها فقط إذا لوحظ هذا التداخل أيضا ً من خلال مكدس z للصورة. لمراقبة السلوك الديناميكي للبروتينات الفلورية مع مرور الوقت استخدم أداة Kymograph متعددة الموجودة ضمن القائمة تحليل. تُظهر الصورة الناتجة حركة إشارة الفلورسنت من خلال سلسلة من اللقطات المكثفة في كل شريحة من مكدس z، الذي يمثل نقاط زمنية فردية. استخدم “أداة القنوات” كما هو موضح في الخطوة 5.6 لعزل كائن الفائدة في القناة الصحيحة. تأكد من أن الكائن أو البنية المحددة لا تتحول بشكل كبير من خلال مكدس z. ضع خط مستقيم أو مستطيل فوق الكائن، وحدد أداة Kymograph متعددة من القائمة تحليل، وأدخل العرض المطلوب للخط الذي يتراكب مع الكائن. إنشاء لوحات الصور التي تظهر الديناميات النووية عبر إطار زمني معين باستخدام “أداة القنوات” كما هو موضح في الخطوة 5.6 وعن طريق تحديد أدوات مكدسات وجعل المونتاج من القائمة صورة. في الإطار المنبثق “جعل المونتاج”، أدخل عدد الأعمدة والصفوف المطلوبة، وحدّد عامل مقياس 1.0، واختر الشرائح الأولى والأخيرة (الإطارات الزمنية)، وتغيير عرض الحدود إلى 5 على الأقل قبل الضغط على موافق. من الممكن اختيار الصور التي تظهر في المكدس عن طريق تغيير الزيادات لتناسب التسلسل المطلوب. لإنشاء فيلم، قم بتحميل hyperstack المطلوب، وحدد حفظ كملف avi من القائمة ملف، واختر لا شيء للضغط ، وأدخل معدل إطار من 2-8 إطارات في الثانية. حدد الأمر جعل المونتاج أثناء انتقاء مركب في “أداة القنوات” لدمج أو فصل كافة الألوان التي تتضمن الصورة.ملاحظة: يتم توفير ملفين avi (Movie1-2)في هذا البروتوكول. استخدامها في فيجي لمحاولة ميزات مختلفة أبرز خلال الخطوة 5. لإظهار خلية تمثيلية واحدة، استخدم التحويل والتدوير من قائمة الصورة وأدخل درجات الاستدارة. تقوم الأرقام السالبة بتدوير الكائنات إلى اليسار، بينما تقوم القيم الموجبة بتدوير الكائنات إلى اليمين. بمجرد أن تكون الخلية في الاتجاه الصحيح، ارسم مستطيلاً يشمل الخلية بأكملها من خلال مكدس z أو أثناء الأطر الزمنية المثيرة للاهتمام وحدد اقتصاص من قائمة الصورة. تابع كما هو مذكور في الخطوة 5.16 و 5.16.1 لإنشاء لوحة صور أو فيلم. أضف شريط مقياس إلى لوحة الصور أو الفيلم عن طريق تحديد أدوات وشريط مقياس من القائمة تحليل. في النافذة المنبثقة شريط مقياس، أدخل 5-15 للعرض في ميكرون للخلايا المفردة أو 100-250 لحقول العرض بأكملها، واختر الأبيض أو الأسود للون، واختر موقعًا مناسبًا لوضع شريط المقياس. بالنسبة للأفلام، من المفيد إظهار تقدم الوقت أثناء الأحداث النووية. لإظهار التغير الزمني بين الإطارات، حدد صورة، انقر على مكدسات، استخدم أداة “الوقت Stamper” ، قم بالإشارة إلى إطار البدء في السلسلة الزمنية ، وحدد موقعًا مناسبًا لعرض الوقت.
Representative Results
سواء تم استخدام التصوير بالخلايا الحية لداء الميوسيس أو داء الميوسيس، فمن الضروري استخدام خلايا الخميرة الانشطارية الصحية قبل إجراء أي نوع من المراقبة. تعتمد جودة البيانات الناتجة بشكل كبير على مواد البداية. إذا تجويع الخلايا بسبب محدودية المغذيات أو فرط النمو، فإنها سوف تظهر الفراغات الزائدة وانخفاض حجم الخلية (المجاعة، الشكل 2A). بالنسبة لتجارب الـ mitosis، من الأفضل تجنب استخدام الخلايا التي تظهر الإجهاد الخلوي (التجويع، الشكل 2A). وإلا، فإن النتائج التجريبية ستكون غير متسقة وغير قابلة للاستنساخ. للتحايل على هذا القيد، اختر الضوابط النوع البري السليم وتصبح على دراية بالأنماط الظاهرية المختلفة للمتحولين من الفائدة. على سبيل المثال، الخلايا المصوّرة المتعطشة لمدة 12 ساعة تتوقف عن تكرار الحمض النووي بشكل نشط. منذ Tos4-GFP يرتبط التعبير مع G1 / S-المرحلة النشاط22،23، الخلايا اللوغاريتمية التي تحمل هذه العلامة وواحدة للتقسيم النووي (Sad1-DsRed10) تظهر التعبير عن عموم النووية Tos4-GFP، Sad1-DsRed البؤر الفصل، والحاجز المستمر (مما يشير إلى النسخ المتماثل للحمض النووي النشط وتقسيم الخلايا) (سجل، الشكل 2A)،في حين أن الخلايا المتعطشة لا تظهر مثل هذا النشاط (المجاعة، الشكل 2A). هذه النتيجة تتفق مع آثار الحد من المواد الغذائية في الخميرة الانشطارية، مما يقلل من النسخ في G1، ينشط نقطة تفتيش دورة الخلية G1 / S، ويعزز دخول G05. بالنسبة لتجارب داء الميوسة، يجب أن تنمو الخلايا إلى كثافة عالية، ولكن دون الوصول إلى المرحلة الثابتة. بعد ذلك، يتم خلط الخلايا من كلا النوعين زميله وحضانة معا في وسائل الإعلام النيتروجين منخفضة. الفشل في التزاوج، كما هو الحال عندما لا تتضور جوعا الخلايا بما فيه الكفاية من النيتروجين، وسوف تمنعهم من دخول meiosis (غير فعالة، الشكل 2B). اللف قوية من تعليق خلية التزاوج يزيد من التفاعل من خلية إلى خلية، وبالتالي يشير إلى التزاوج الناجح وكفاءة الحث meiotic (كفاءة، الشكل 2B). منصات هلام أغاروز والاضطراب المادي لكتل الخلية ضمان التصور السليمللخلايا واحدة أو asci (سجل، الشكل 2A؛ كفاءة، الشكل 2B). منصات يجب أن توفر منصة جامدة، ولكن رطبة التي يتم إصلاح الخلايا في وقت واحد في مكان ومحمية من الجفاف. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون منصات سميكة بما فيه الكفاية لتحمل التغيرات الناجمة عن التبخر وتوفير سطح التسوية التي تسمح التركيز السليم في جميع أنحاء الحصول على الصور (الشكل1C). دوران غطاء ضروري لفصل ونشر الخلايا داخل المجاميع التزاوج (الشكل1F; كفاءة، الشكل 2B). دون هذه الخطوة، ويلاحظ عدد قليل من asci ولكن العديد من الخلايا الهابلويد لأن asci تصبح محاصرين داخل طبقات لا يمكن الوصول إليها من كتل التزاوج، في حين أن الخلايا الهابلويد حرة في ملء جميع البقع أحادية الطبقة المتاحة (الشكل2B). حتى بالنسبة للتجارب الميتوتيكية، حيث تكتل الخلايا أقل إشكالية، دوران غطاء يتحرك الخلايا حول لوحة لإنشاء طبقة خلية واحدة مع مساحة كافية بين الخلايا للحد من آثار الازدحام والسماح لازدواجية الخلايا (سجل، الشكل 2A ). Atb2 هو مكون α-tubulin المشاركة في فصل الكروموسوم في المطثّن الخميرة الانشطارية وmeiosis7,14. عندما الموسومة الفلورسنت، وهذا المكون الهيكل الخلوي يسمح لفحص المراحل التي تميز الفصل النووي في السيتوسية. خلال المرحلة التمهيدية (0′-20’، الشكل 3A)،تحدث النوى من المغزل الميتوتيك في الجانب النووي من أجسام القطب المغزل (SPBs)، كما كشفت عن هاب2-mRFP الألياف المنصوص عليها ضد الخلفية Htt1-GFP5 عموم النووية. خلال الانتقال metaphase-anaphase (20 ‘-40’، الشكل 3A)المغزل الميتوتيك يمتد إلى الخارج وتنقسم النواة إلى قسمين. كما يدخل الخلية telophase (60 ‘-80’، الشكل 3A)،Atb2-mRFP يوسع ثنائي الاتجاه حتى يتم فصل الكروموسومات تماما. بعد هذه النقطة، ألياف Atb2-mRFP إعادة تجميع وتنتشر عبر سطح الخلية لاستعادة شكلها بين المراحل في كل من الخلايا ابنة الناتجة. يحدث السيتوكينيسيس (>120’،الشكل 3A)فقط بعد أشكال الحاجز ويقسم الخلية عن طريق الانشطار. بعد التغيرات في كثافة Hht1-GFP على مدى دورة الميتوتيك يكشف عن ثلاث خطوات هامة في الديناميات النووية: metaphase-anaphase (كثافة متوسطة، ضغط الحمض النووي: 20 ‘-40’،الشكل 3A-B)،التيلوفاسي (كثافة منخفضة، فصل الحمض النووي: 60’-80’، الشكل 3ألف-باء)وG1 (زيادة الكثافة، وازدواجية الحمض النووي: 100 ‘-120’،الشكل 3A-B). وبالمثل، ولكن باستخدام الخلايا التي تحمل فقط Hht1-mRFP واستخدام أداة متعددة kymograph (انظر الخطوة 5.15) في فيجي، فمن الممكن لمراقبة الانقسام الميتوتيك من المرحلة الفوقية إلى المرحلة التيلفيس وتقييم الحركات النووية التي تنطوي عليها خلال الكروماتيد الأخت المناسبة الفصل (عادي، الشكل 3C). وتظهر أجهزة التصوير الشعاعي للعزل الخاطئ نشاط الإشارة بين المسارين النوويين الرئيسيين، مما يشير إلى احتمال حدوث سوء فصل بسبب تجزئة الكروموسومات أو الفصل غير الملائم للكروماتيد (متخلفة، الشكل 3جيم). كما ذكر سابقا، في الخميرة الناشئة والانشطارية، يتم تدوين Tos4 في G1 ويعمل خلال النسخ المتماثل الحمض النووي في المرحلة S22،23. ويمكن ملاحظة ذلك في kymograph حيث يزيد التعبير Tos4-GFP في النواة بعد S1-DsRed10 بؤر الانتقال إلى اتجاهات معاكسة (مما يدل على الانقسام النووي)، ولكن قبل أشكال الحاجز، الذي يسبق السيتوكينيسيس (39’، الشكل 3D ; 36’، الشكل 3E). تبدأ مرحلة النشاط العالي Tos4-GFP في نهاية انتقال M-G1/S (45’، الشكل 3E)وتنتهي في G2 (>60’، الشكل 3E)،مباشرة بعد تقسيم الخلية. في حين تنتشر إلى حد كبير خلال G1، Tos4-GFP كثافة إشارة يزيد بعد الطور وخلال المرحلة S وشارك في توطين مع البؤر Sad1-DsRed منفصلة (45 ‘-60’، الشكل 3E). هذه النتيجة تكشف عن فترة الحاجز في الخميرة الانشطارية عندما بدأت ازدواجية الجينوم في خلايا ابنة (G1 / S)، ولكن السيتوكينيسيس لم يحدث حتى الآن. Hht1 هو histone H3 في الخميرة الانشطارية ويتم تعديلها عادة مع علامات الفلورسنت لتصور الحمض النووي5،14. في الميتوسية، مع انتقال الخلايا من المرحلة الفوقية إلى المرحلة التيلوفاسية (20’-120’، الشكل 3A)،لوحظ تغييران مميزان في الكتلة النووية. التغيير الأول ينطوي على تقلص الحجم النووي في المرحلة الفوقية (20’، الشكل 3A) ، في حين يظهر الثاني نواة تقسيم خلال anaphase (40 ‘، الشكل 3A). وإلى جانب تقاسم هذه التغييرات مع الخلايا الميتوتيكية، تظهر الخلايا الميوتيكية تذبذباً نووياً (أي ذيل الحصان) (-100′ إلى -50’، الشكل 4A-B)أثناء إعادة التركيب المتجانس والمزيد من التخفيض في حجم النواة في نهاية المرحلة الثانية (70’-90’، الشكل 4ألف). يستخدم Hht1-mRFP لفحص الأنماط الظاهرية للعزل الخاطئ مثل الكروموسومات المتخلفة أو المجزأة (التخلف، الشكل 3C). كما أنها تستخدم لمراقبة ووصف الديناميات النووية في كل مرحلة من مراحل داء الموهيس (الشكل4A-B). الكتلة النووية كبيرة وتتقلب في الحجم خلال الكثير من ذيل الخيل (HT: -100 ‘ إلى -50 ‘، الشكل 4A-B)). كما تدخل الخلايا metaphase (MT: -40′ إلى 0’، الشكل 4A-B)،وانخفاض الحجم النووي والتذبذب، بما يتفق مع زيادة نشاط التكثيف في هذه المرحلة. ويرتبط ظهور كل من الطور الأول (MI: 10′-60’، الشكل 4A-B)والثاني (MII: 70′-90’، الشكل 4A-B)مع مزيد من التخفيض النووي وعدم وجود حركة نووية، والتي ترتبط بشكل جيد مع الشعبتين النوويتين التي تميز meiosis الأول والثاني (MI & MII). وهكذا، يرتبط داء الموهيوس بتقلبات الحجم النووي عندما تتماشى الكروموسومات المتجانسة وتعيد دمجها ومع تخفيضات الحجم النووي بعد جولتين من فصل الكروموسوم. Alleles التي تغير هذه الديناميات النووية من المرجح أن ترتبط مع تنظيم استقرار الجينوم في meiosis12,13. Rec8 هو الوحدة الفرعية α-kleisin من الكوهسين meiotic في الخميرة الانشطارية. يتم تحميله على الكروماتين بعد النسخ المتماثل الحمض النووي (mei-S) ويحافظ على الكروماتيدس الشقيقة المربوطة ببعضها البعض حتى aphase II. بعد المرحلة الفوقية الأولى، تتم إزالة Rec8 من أذرع الكروموسوم بواسطة separase ومحمي في سنترومير بواسطة Sgo1-PP2A. في نهاية الفصل المتجانس، يتم القضاء على Rec8 أيضا في سنترومير، مما يسمحلفصل الكروماتيد الأخت (الشكل5A)6،24. Rec8-GFP جنبا إلى جنب مع علامات فصل الكروموسوم مثل Sad1-DsRed أو Hht1-mRFP تسمح لتصور ديناميات التماسك خلال meiosis. إشارة Rec8-GFP هي عموم النووية خلال mei-S (<<-90', الشكل 5A-B), prophase I (-90' إلى -50', الشكل 5A-B), وmetaphase I (-40′ إلى 0’, الشكل 5A-B). هذه الملاحظة تكشف عن ارتباط Rec8-GFP على طول محاور الكروموسومات التي تتبع ازدواجية الحمض النووي. كما تدخل الخلايا الطور الأول (10 ‘، الشكل 5A-B)،تنخفض كثافة Rec8-GFP في جميع أنحاء النواة ولكن لا تزال قوية في سنترومير، حيث أنها تشكل التركيز في كل كتلة نووية (20′-70’، الشكل 5A-B). هذه النتيجة تتفق مع تدهور Rec8-GFP على طول الأسلحة الكروموسومية ولكن ليس في سنترومير، الذي يترتب على ذلك بعد الفصل المتجانس. قبل الطور الثاني، يختفي تركيز Rec8، ويحرر الكروماتيد الشقيقة للفصل في MII(70’-80’، الشكل 5A-B). وبالتالي، فإن علامة Rec8-GFP مفيدة لدراسة الظروف التي تعطل إنشاء وإزالة والاستقرار العام للتماسك الميوتيك. يقترن مع علامة من الانقسام النووي مثل Hht1-mRFP5،13، يمكن استخدام Rec8-GFP لمعالجة المسائل المتعلقة بكيفية توقيت التماسك والاستقرار قبل وأثناء الانقسام يؤثر على الفصل الكروموسومي السليم12 ،13. لا يتناول هذا البروتوكول البروتينات التي تحدث دينامياتها في المقام الأول في السيتوسول. ومع ذلك، يظهر الجدول الأول بعض البروتينات الخلوية التي تستخدم عادة لفحص الهيكل الخلوي وعمليات الغشاء اللازمة لبطانة الرحم، وexocytosis، والخلايا من بين عمليات أخرى. الشكل 1: إعداد منصات أغاروز لتصوير الخلايا الحية. (أ) إعداد الشريحة إعداد تجميعها باستخدام حامل تلميح ماصة، شريط المختبر، والشرائح المجهر. وضع الشرائح عمودي على بعضها البعض يخلق جيب حيث تشكل لوحة أغاروز. إضافة قطع شريط المختبر على الجانبين يضبط عرض لوحة أغاروز إلى المواصفات المطلوبة. (B) يتم السماح لـ Molten agarose بتهدئة الوضع قبل وضعه على شرائح المجهر لصنع منصات. في هذه الخطوة، فمن الضروري الاستغناء عن حجم أجاروز ببطء لتجنب خلق فقاعات الهواء. (C) يتم وضع الشريحة العليا على بقعة أجاروز الاستغناء عنها لتشكيل لوحة دائرية مع سطح مستقيم، حتى حواف، وليس الشقوق أجاروز مرئية. (D) بعد وضع عينة من تعليق الخلية على لوحة أغاروز، عكس الشريحة ووضع فوق منشفة ورقية خالية من الوبر لإزالة المتوسطة السائلة اضافية. (E) وضع بعناية غطاء على لوحة أغاروز، والتأكد من عدم فخ أي فقاعات الهواء والتحقق من أن الطائرة التركيز مسطحة لتجنب تحويل الخلية والتركيز القضايا. (F) ببطء وبحذر، تدوير coverslip في اتجاه عقارب الساعة لتعطيل كتل الخلية وتوليد أحادية الخلية التي تسمح لتوسيع الخلية وأفضل التصور الخلية. (ع،ح) استخدم خليط هيدروكربوني ساخن لختم منصات أجاروز والسماح لها بمعادلة درجة الحرارة المطلوبة قبل التصوير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: اختيار الخلايا الصحيحة. (أ) تظهر أعلى لوحات خلايا الخميرة الانشطارية اليسار إلى تجويع في EMM بالإضافة إلى المكملات الغذائية ل 72 ح وأسفل لوحة يظهر الخلايا التي تمر النمو اللوغاريتمي. في الخلايا التي تترك لتجويع، يمكن تقدير مورفولوجيا الخلايا الصغيرة. يظهر السهم الأحمر المفتوح حبيبات الفراغ التي هي سمة من سمات المجاعة. في الثقافات اللوغاريتمية، تكثر الخلايا التي تظهر مورفولوجيات ممدودة والحاجز (السهم الأحمر)، مما يشير إلى ديناميات ركوب الدراجات النشطة. تُظهر اللوحات اليمنى خلايا تعبر عن إشارات Tos4-GFP وSad1-DsRed أثناء المجاعة والانتشار. [بن-نوكل] [تووس4-غفب] تعبير و [سد1-دسد] إشارات أنّ [كليندتيف تو] مضادّة خلية أعمدة رأيت أثناء انتشار نشطة, غير أنّ لا في تجويع. (B) تظهر اللوحة العليا خلايا من نفس نوع زميله (h+) تفشل في التزاوج بكفاءة. السهم الأحمر المفتوح يظهر زوج من الخلايا الفراغية التي تمر karyogamy. هذا ليس غير عادي في الثقافات من h + الخلايا، حيث 10٪ من الخلايا يمكن التبديل زميله من نوع إلى ح-. لوحة أسفل يظهر asci الناتجة عن كفاءة التزاوج. Zygotic asci تأخذ أشكال متعددة بما في ذلك متعرج ة (السهم الأحمر) وأشكال خلية الموز (السهم الأحمر المفتوح). شريط مقياس = 5 ميكرومتر في الطول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: الديناميات النووية المنية. (أ) تم اتباع البروتينات H3 (Hht1-GFP) وmicrotubule (Atb2-mRFP) خلال دورة واحدة من الميكروتوسي (120 دقيقة). يتم عرض الإشارات الفردية لHht1-GFP و Atb2-mRFP في لوحات بالأبيض والأسود، في حين يظهر دمج BF لهم في الألوان الخاصة بهم. (ب) القياس الكمي لكثافة Hht1-mGFP على دورة ميتوتيك. ويدل التغير في مستويات Hht1 على الانقسام النووي أثناء الإنحراف وازدواجية الحمض النووي في G1. (C) Kymographs التي تظهر الفصل الطبيعي أو غير الطبيعي في الانقسام المتعدد الحالات حيث المسارات النووية الناتجة إما تقسيم والحفاظ على سلامة الحمض النووي أو الانحراف وتعزيز تجزئة الكروموسومات أو فصل الكروماتيد السابق لأوانه، على التوالي. (دال،هاء) لوحات Kymograph وميكروغرافيا تبين مدة M-إلى-G1/S التي كشف عنها الفصل بين Sad1-DsRed وظهور إشارات Tos4-GFP النووية. لاحظ اللوحات الوسطى في E التي تم إنشاؤها باستخدام FIRE LUT في فيجي لإنشاء خريطة حرارية تخرج كثافة التي تسهل تحديد البقع مع ارتفاع التعبير Tos4-GFP؛ في هذه الحالة، المترجمة إلى النواة وتداخل إشارات Sad1-DsRed، كما هو متوقع. شريط مقياس = 5 ميكرومتر في الطول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: الديناميات النووية الميوتيكية. (أ) سلسلة لوحة تظهر الحركة، والضغط، وتقسيم النواة (Hht1-mRFP) أثناء الانقسام. يظهر ذيل الخيل (HT) التذبذبات النووية واسعة النطاق جنبا إلى جنب تليها Metaphase (MT)، حيث تنخفض الحركة الجانبية النووية وتوقف تماما قبل الطور الأول. في meiosis I (MI)، تنقسم الكتلة النووية الرئيسية إلى قسمين، في حين يتم إنشاء أربع نوى في meiosis II (MII) خلال عملية فصل الكروماتيد الشقيقة. (ب) التحديد الكمي لتغير المنطقة النووية (Hht1-mRFP) في المرحلة التمهيدية، المرحلة الفوقية، MI وMII. المنطقة النووية ديناميكية خلال التذبذبات HT، يصبح مكثفا في MT، والمزيد من الانخفاض في الحجم خلال MI & MII، حيث لوحظ تنقص الحركة النووية (المحور النووي الطويل). ويستند قياس أطول محور نووي (المحور النووي الطويل) إلى فكرة أنه مع امتداد الدائرة، فإنه يتوقف عن أن يكون قطره ثابتًا ويولد محورين رئيسيين على الأقل: طويل ًا وقصيرًا. وهكذا، عند رصد التغيرات في النواة، فإن التغيرات في المحور الطويل أو القصير توفر مؤشرات على الحركة النووية. شريط مقياس = 5 ميكرومتر في الطول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: ديناميات الكويسين الميوتيك. (أ) سلسلة لوحة تبين كيف يرتبط تغيير إشارة Rec8-GFP مع الديناميات النووية meiotic. أثناء [هت] و [مت], [رك8-غفب] إشارة [بن-نفب] [بن-نل] ويتبع حركة نوويّة ([هت1-مفرب]). في MI، يتبدد Rec8-GFP من النواة، مما يترك فقط زوج من البؤر، وهو ما يتسق مع إزالة Rec8 من الأسلحة الكروموسومية وإنشاء حماية Sgo1-PP2A في سنترومير. مع اقتراب الخلية MII، تبدأ بؤر Rec8-GFP في الاختفاء ولم تعد ينظر إليها مباشرة قبل المرحلة الثانية. (ب) التحديد الكمي لكثافة Rec8-GFP من HT إلى MII. على غرار ما ينظر إليه في A، إشارة GFP عالية من خلال HT وMT، وينخفض بشكل كبير خلال MI وتختفي تماما في MII. هذا النمط يدعم ديناميات الcohesin في الأسلحة الكروموسومية وسنترومير، حيث أنه يبقي الكروماتيد الشقيقة المربوطة حتى على استعداد لفصلها في MII. شريط مقياس = 5 ميكرومتر في الطول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. البروتين وظيفه تعليقات العلامه مراجع محمد الدوسري الهيستون H3 المشاركة في تغليف الحمض النووي يستخدم لفحص ديناميات الكروموسومات Hht1-mRFP 5,14 Tos4 يحدث وظيفة Tos4 خلال مرحلة G1 تم توظيفه لدراسة توقيت G1 Tos4-GFP 22,23 Rad21/Rec8 الوحدات الفرعية Cohesin المشاركة في الحفاظ على الكروماتيدس الشقيقة معا بعد النسخ المتماثل يستخدم لتحليل استقرار التماسك أثناء الـ mitotic (Rad21) والفصل الميائية (Rec8) Rad21-GFP/Rec8-GFP 6,24 محمد الدوسري يحدث نشاط RPA أثناء إصلاح الحمض النووي الميتوتيك، وإعادة تركيب الميكوتيك، وينتهي في المرحلة الفوقية يستخدم لدراسة إصلاح الحمض النووي في ميتوسيس وإعادة تركيب ديناميات في meiosis Rad11-YFP 5,13 محمد الدوسري يتم ّ [رد52] [أكفيتي] أثناء [ميتوتيك] [دنا] إصلاح و [ميوتيك] إعادة إدماج يستخدم لدراسة إصلاح الحمض النووي في ميتوسيس وإعادة تركيب ديناميات في meiosis Rad52-CFP 5,13 في الرّاصي1 Histone H3 CENP-A يُترجم على وجه التحديد في سنترومير تستخدم لمتابعة ديناميات فصل الكروموسومات في الداء الميتوميووية Cnp1-mCherry 13 محمد الدوسري بروتين التجانس HP1 المشاركة في تشكيل heterochromatin يستخدم لدراسة تعبئة هيتروكروماتين في سنترومير والتيلوميرات Swi6-GFP 13 محمد الدوسري تشارك Sad1 في توطين جسم القطب المغزل إلى المغلف النووي يستخدم لتحليل فصل الكروموسومات في الداء الميتوميووية وداء المكورات Sad1-mCherry 10 سنوات سيتوسول والغشاء في سن الـ 10 توبولين ألفا 2 تشارك في تنظيم الهيكل الخلوي الأنابيب الدقيقة يستخدم لفحص فصل الكروموسومات في الداء الميتوميووية Atb2-mRFP 7,14 Ync13 منظم الإنفسيد وبطانة الرحم المشاركة في النقل بوساطة الحويصلة يستخدم لدراسة سلامة جدار الخلية أثناء السيتوكينية Ync13-mECitrine 25 Rlc1 وحدة فرعية Myosin II تشارك في تقلص حلقة العقد تستخدم لاستكشاف ديناميات نضج الحاجز والانكماش RIc1-mCherry 25 Ccr1 NADPH-cytochrome p450 اختزال التي هي جزء من ER, البلازما, والغشاء الخارجي mitochrondrial يستخدم لفحص الديناميات المرتبطة بالغشاء مثل بطانة الرحم، وexocytosis، والخلايا Ccr1N-GFP 5 Gef1 عامل تبادل رو غوانيل-نوكليوتيد الذي ينطوي على إنشاء وصيانة قطبية الخلايا يستخدم لفحص ديناميات قطبية الخلايا العالمية المعتمدة على الأنابيب الدقيقة Gef1-mCherry-GBP 26 محمد الدوسري فورمين تشارك في الجمعية التركيز الانصهار أكتين خلال cytogamy تستخدم لدراسة ديناميات الانصهار المرتبطة الانشطار الخميرة التزاوج Fus1-sfGFP 27 Mnn9 الوحدة الفرعية Mannolsyltransferase المشاركة في البروتين N-المرتبطة غليكوزيلاشن في جهاز غولجي يعمل لدراسة نضج البضائع في غولجي كما أنها تتقدم من رابطة الدول المستقلة-غولجي إلى عبر-غولجي Mnn9-mCherry 28 العدد 1 عامل الإرساء القشري للدينين المشاركة في ذيل الخيل تستخدم لفحص الداينين تعتمد على الميتوكوندريا الراسية خلال التذبذب النووي في المرحلة التمهيدية meiotic I Num1-yEGFP 29 الجدول 1: علامات الديناميات النووية والدورية. فيلم 1: M-إلى-G1/S الانتقال تظهر هيئة القطب المغزل (SPB; [سد1-دسد]) فصل سابقة حاجز وتراكم من [تو4-غفب] إشارة نوويّة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.) الفيلم 2: الانتهاء من دورة ميتوتيك تظهر microtubule (Atb2-mRFP) تمديد المرتبطة النووية (Hht1-GFP) تقسيم. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
Discussion
التصوير بالخلايا الحية أثناء الداء الميتومي وداء الموهيوس يوفر الفرصة لدراسة الديناميات النووية دون تعطيل كبير فيزيولوجيا الخميرة الانشطارية أثناء الحصول على البيانات. ومع ذلك، يجب توخي الحذر لضمان نمو الخلايا إلى الكثافات المطلوبة خالية من الضغوط البيئية؛ وبالنسبة للداء الليهوسي، يتم تصوير الخلايا خلال وقت التمايز النهائي وليس في وقت مبكر جدا أو في وقت متأخر. الازدحام الخلوي الزائد، والمجاعة، ودرجات حرارة النمو غير المناسبة هي العوامل الشائعة التي تسهم في عمليات الرصد غير القابلة للاستنساخ. وبالإضافة إلى ذلك، خلال بناء سلالة، من المهم جدا لاختبار أن علامات الفلورسنت لا تتداخل مع وظائف الجينات المستهدفة ولا تؤثر على اللياقة البدنية الخلية عموما. قد يؤدي الفشل في فحص الأنماط الظاهرية للسلالات التي تحمل علامات الفلورسنت عن نتائج غير متناسقة وغير قابلة للمقارنة عبر الأنماط الجينية المماثلة.
على الرغم من أن منصات أجاروز المجهر بسيطة لتجميع، فإنها يمكن أن تشكل أيضا عقبة في الحصول على بيانات التصوير قيمة. إنشاء منصات أغاروز بسيط مثل وضع ثلاثة شرائح المجهر موازية لبعضها البعض، والاستغناء عن الأغروز المنصهر على الشريحة الوسطى، ووضع الشريحة التي تنقل الجزء العلوي من الشرائح الأخرى. ومع ذلك، فمن المفيد تجميع جهاز صانع الشريحة التي تسمح لتعديلات العرض لتصنيع مقاومة، ومنصات أغاروز محددة الوضع. صانع الشريحة بسيطة أن يعطي مرونة عرض وسادة يتكون من منصة (حامل نصائح ماصة أو مقاعد البدلاء)، واثنين من الشرائح المجهر، وشريط المختبر بمثابة آلية ضبط العرض وسادة (الشكل1A). سوف سمك وسادة الدقيق تعتمد على متطلبات وقت التصوير، العلامة التجارية agarose، درجة الحرارة، مانع التسرب coverslip، معدل التبخر، الخ. وبالتالي، من المهم معايرة نظام التصوير قبل الحصول على البيانات لزيادة التكرار التقني وتعزيزجودة التصوير بالخلايا الحية 1،2،3. سطح الوسادة، والصلابة، وتكوين ضرورية خلال الحصول على صورة لفترات طويلة. Agarose لديه الفلورة الخلفية منخفضة، ويمكن أن مصبوب بسهولة، وعند التركيز المناسب، ويقاوم تشوه الهيكلية بسبب التبخر. وعلاوة على ذلك، الجمع بين وسائل الإعلام الخميرة الانشطار مع أغاروز لا يضر جودة الصورة ويسمح للمراقبة الموسعة من دورات mitoses وmeiosis متعددة. أيضا، من المهم تجنب أي فقاعات الهواء للميكروسكوب الفاصل الزمني. داخل منصات أغاروز وداخل العينة، وجيوب الهواء توسيع مع مرور الوقت، مما تسبب في تحويل الخلايا وتعطيل الطائرات البؤرية. شريطة أن تنتشر الخلايا بكفاءة عن طريق دوران غطاء، يمكن للباحثين متابعة العمليات الميتومية عبر عدة أجيال والأحداث meiotic من الانصهار النووي إلى sporulation. صنع واختيار اللوحة المناسبة لتجارب التصوير يستغرق وقتا لإتقان، ولكن بمجرد تحقيقه، يمكن أن تسهم في ملاحظات المجهر مفيدة للغاية.
كما هو الحال مع طرق أخرى، المجهرية الخلية الحية ليست خالية من القيود التقنية. استخدام البروتينات ذات العلامات الفلورية يدخل الحدود إلى التجارب التي تحد من نطاق ما يمكن دراسته. تبييض الصور وسمية الصورة هي مشاكل نموذجية من اكتساب الصورة لفترات طويلة. ويمكن التصدي لها بعدم تعريض الخلايا لأطوال موجية قصيرة لفترة طويلة جدا أو في كثير من الأحيان. بالنسبة للتجارب التي تشمل GFP، CFP، YFP، mRFP، وDsRed، البروتينات الفلورية النموذجية المستخدمة في تصوير الخلايا الحية الخميرة الانشطارية، فمن الشائع استخدام 5-15٪ ضوء الإثارة و 100-500 مللي ثانية وقت التعرض للتجارب الروتينية. هذه المعلمات تتغير، ومع ذلك، وفقا لمتطلبات التجربة المحددة للباحث. وبالإضافة إلى ذلك، z-مداخن تتألف من 9-13 أقسام مع تباعد 0.5 درجة مئوية باستخدام هدف 60X يكفي لحل سمك خلية الخميرة الانشطارية. وعلاوة على ذلك، من المهم التأكد من أن علامات الفلورسنت لا تعطل التنظيم السليم أو وظيفة البروتينات المستهدفة أو تولد الأنماط الظاهرية. وبالتالي، من المستحسن بناء سلالات تحتوي على علامات فلورية وتقاربية مختلفة لنفس الجين المستهدف لدعم الملاحظات بوسائل مختلفة. وعلاوة على ذلك، تقع على عاتق الباحثين مسؤولية ضمان إعادة إنتاج البارامترات التجريبية عبر التجارب وأن تكون البيانات المجمعة ملائمة للتحليل في المراحل النهائية1و3. ولا يمكن لأي تكنولوجيا أن تحل محل الممارسة التي تم اختبارها على مر الزمن والمتمثلة في التحقق بدقة من النظم التجريبية عن طريق المراقبة الدقيقة والفحص الدقيق للخطية في الكشف عن إشارات الفلورسنت.
وأخيرا، من الأهمية بمكان تحليل البيانات المجهرية في الأشكال التي لا تعدل الصور الخام. توفر فيجي أدوات توثيق ممتازة لتتبع قياسات البيانات الخام وتسمح للباحثين بفحص معلمات الخلايا المختلفة في جلسة واحدة. هذه الميزات، فضلا عن ثروتها من الدروس على الانترنت وتغطية أدبية واسعة النطاق، وجعل فيجي أداة هامة لقياس وتحليل وتقديم بيانات التصوير بالخلايا الحية التي تصف الديناميات النووية للخميرة الانشطارية في الداء الميتوميووية وmeiosis.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفان أن يشكرا ناتاليا لا فوركاد ومون لافيرت على جعل إعداد هذه المخطوطة مسعى أكثر متعة. بفضل أعضاء مختبر فورسبورغ الذين ساهموا في إنجاز هذا العمل ببصيرتهم وأفكارهم التجريبية ودعمهم المعنوي. وقد تم دعم هذا المشروع من قبل NIGMS R35 GM118109 إلى SLF.
Materials
| 60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
| Adenine | Sigma | A-8751 | |
| Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
| Biotin | Sigma | B-4501 | |
| Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
| CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
| Citric acid | Sigma | C-0759 | |
| Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
| Cover slip | VWR | 16004-302 | |
| CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
| DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
| Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
| FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
| Histidine | Sigma | H8125-100g | |
| Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
| Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
| Incubator | Shell lab | #3015 | |
| Inositol | Sigma | I-5125 | |
| Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
| Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
| Leucine | Sigma | L8912-100g | |
| Lysine | Sigma | L5626-500g | |
| Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
| MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
| MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
| Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
| MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
| Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
| Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
| Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
| Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
| Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
| Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
| softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
| Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
| Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
| Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
| Vaseline | Equaline | F79658 | |
| yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
| Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
| ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |
Riferimenti
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy–tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. DNA Replication. (13-41), (2015).
- Lee, J. Y., Kitaoka, M. A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).
- Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast. Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).
- Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly. Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination. Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).
- Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction. Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).
- Mastro, T. L., Forsburg, S. L. Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF). Genetica. 198 (4), 1457-1472 (2014).
- Escorcia, W., Forsburg, S. L. Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).
- Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation. Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).
- Forsburg, S. L., Rhind, N. Basic methods for fission yeast. Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).
- Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in enzymology. 470, 759-795 (2010).
- . ImageJ User Guide — IJ 1.46 Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2019)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes. The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).
- Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae. PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).
- Watanabe, Y., Nurse, P. Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis. Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).
- Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).
- Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis. Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).
- Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).
- Kurokawa, K., et al. Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. , (2019).
- Kraft, L. M., Lackner, L. L. A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring. Molecular Biology of the Cell. , (2019).
Citazione di questo articolo
Escorcia, W., Shen, K., Yuan, J., Forsburg, S. L. Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59822, doi:10.3791/59822 (2019).