리스테리아 단세포 유전자 감염 다음 마우스 비장에서 시투 인터페론 감마 생산의 이미징
Summary
여기서, 우리는 뮤린 이차 림프기관에서 사이토카인 인터페론 감마를 분비하는 세포의 내부 국소화를 가시화하는 간단한 공초점 이미징 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 다양한 조직에서 다른 사이토카인의 시각화를 위해 확장될 수 있다.
Abstract
사이토카인은 세포에 의해 분비되는 작은 단백질로, 효과적인 면역 반응에 중요한 세포-세포 통신을 중재합니다. 사이토 카인의 한 가지 특징은 그들의 pleiotropism, 그들은 에 의해 생산 되 고 세포 유형의 다수에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 어떤 세포가 사이토 카인을 생산하고 있는지뿐만 아니라 보다 구체적인 치료법을 정의하기 위해 어떤 환경에서도 이를 이해하는 것이 중요합니다. 여기서, 우리는 세균 감염 에 이어 자리에서 사이토카인 생산을 시각화하는 방법을 설명한다. 이 기술은 공초점 현미경 검사법에 의해 그들의 모국환경에서 화상 진찰 사이토카인 생성 세포에 의존합니다. 이렇게 하기 위하여는, 조직 단면도는 사이토카인 얼룩과 더불어 다중 세포 모형의 마커를 위해 염색됩니다. 이 방법의 핵심은, 사이토카인 분비가 관심 있는 조직을 수확하기 전에 생체 내에서 직접 차단되어 생산 세포 내부에 축적된 사이토카인을 검출할 수 있게 한다. 이 방법의 장점은 여러 가지입니다. 첫째, 사이토카인이 생성되는 미세 환경이 보존되어 궁극적으로 사이토카인 생산에 필요한 신호와 그 사이토카인의 영향을 받는 세포를 알릴 수 있습니다. 또한, 이 방법은 생산 세포의 인공 체외 재자극에 의존하지 않기 때문에 생체 내에서 사이토카인 생산의 위치를 표시한다. 그러나, 사이토카인을 수신하는 세포에서 사이토카인 다운스트림 시그널링을 동시에 분석하는 것은 불가능하다. 유사하게, 관찰된 사이토카인 신호는 사이토카인 분비가 차단된 시간 창에만 해당한다. 우리는 세포 내 박테리아 리스테리아 monocytogenes에 의하여 마우스 감염 다음 비장에 있는 사이토카인 인터페론 (IFN) 감마의 가시화를 기술하는 동안, 이 방법은 잠재적으로 어떤 사이토카인의 가시화에 적응될 수 있었습니다 대부분의 장기.
Introduction
병원체에 대하여 능률적인 면역 반응을 조율하는 것은 유기체 사이에서 수시로 분산되는 다양한 면역 세포에 의해 표시되는 신호의 복잡한 통합을 요구합니다. 통신하기 위하여는, 이 세포는 사이토카인에게 불린 면역 조절제역할을 하는 다중 생물학 기능을 가진 작은 수용성 단백질을 일으킵니다. 사이토카인 제어 세포 모집, 활성화 및 증식 및 이에 따라면역 반응의 촉진에 핵심적인 선수가 되는 것으로 알려져 있다 1. 효과적인 면역 반응은 특정 신호를 유도하기 위하여 특정 세포를 연결하는 아주 조직된 spatiotemporal 패턴에서 풀어 놓일 사이토카인을 요구합니다. 따라서 사이토카인이 생성되는 미세 환경을 고려하여 사이토카인 생산과 시그널링을 연구하는 것이 중요합니다.
리스테리아 단세포 유전자 (L. monocytogenes)는쥐의 세포 내 병원체에 대한 면역 반응을 연구하는 주요 모델로 사용되는 그람 양성 세포 내 박테리아입니다. 하나의 사이토카인, IFN 감마(IFNγ)는 L. 단핵세포유전자 감염 후 24시간 이내에 빠르게 생성된다. IFNγ를 위해 쓰러진 마우스가 L. monocytogenes 감염에 매우 민감하기 때문에병원체 클리어런스에 필요합니다 2. IFNγ는 흉막성이며 감염3다음에 여러 세포에 의해 생성됩니다. 자연킬러(NK) 세포에 의해 생성된 IFNγ는 직접적인항균 활성4에 필요한 반면, 다른 공급원으로부터IFNγ는 다른 기능을 갖는다는 것을 나타내고 있다. 실제로, 우리 및 다른 사람들은 최근 CD8+ T 세포에 의해 생성된 IFNγ가 T세포 분화 5,6,7을직접 조절하는 데 특정 한 기능을 갖는다는 것을 발견했다. 따라서 IFNγ(및 미세 환경)를 생성하는 세포를 이해하는 것은 그 기능을 해부하는 데 매우 중요합니다.
사이토카인 생산을 연구하는 가장 일반적인 기술은 유세포 측정에 의해 분석된 세포내 사이토카인 염색에 의존합니다. 이 방법을 사용하면 단일 샘플 내에서 세포 표면 마커와 결합된 여러 사이토카인을 동시에 검출할 수 있어 사이토카인 생산을 연구하는 데 매우 유용한 도구를 제공합니다. 그러나 전술한 기술을 사용하면 공간 정보가 손실된다는 의미입니다. 또한, 사이토카인 검출은 종종 사이토카인 검출을 가능하게 하기 위해 시험관내 재자극에 의존한다. 이와 같이, 사이토카인을 생성하는 주어진 세포의 용량이 분석되고, 반드시 그자리에서 실제 사이토카인 분비와 상관관계가 있는 것은 아니다. 다른 방법은 형광 단백질 발현이 사이토카인 전사와 상관관계가 있고 단일 세포 수준 8에서시각화를 허용하는 리포터 마우스를 사용한다. 이 방법은 사이토카인 전사를 그(것)들 에서 추적할 수 있더라도, 유효한 사이토카인 리포터 마우스의 한정된 수의 있습니다. 또한, 전사, 번역 및 분비는 때때로 연결되지 않을 수 있고, 형광 단백질은 그들이 보고하는 사이토카인과는 다른 반감기를 가지며, 이 방법은 때때로 사이토카인 시각화에 적합하지 않다.
여기서, 우리는 단일 세포 해상도에서 공초점 현미경검사법에 의해 사이토카인 생산을 현장에서 시각화하는 방법을 기술한다. 이 기술은 조직 내의 세포 근원 그리고 주변 틈새의 가시화를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 특히 NK 세포 및 항원 특이적 CD8+ T 세포에 의한 IFNγ 생산에 초점을 맞추고, L. monocytogenes 감염 마우스의 비장에서 IFNγ 생산의 시각화를 설명합니다. 그러나, 표적 사이토카인이 세포에서 유지될 수 있는 한, 감염, 염증 또는 자가면역 질환과 같은 사이토카인이 생성되는 다른 상황의 맥락에서 임의의 사이토카인 생산의 특성화에 확장 및 적응될 수 있다. 세포 내 단백질 수송 억제제에 의해.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서, 우리는 마우스에서 L. monocytogenes 감염 다음 비장에서 IFNγ 생산을 시각화하는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 간단하고 다른 조직 및 사이토카인 트리거에 적응될 수 있지만 다음과 같은 측면을 고려해야 합니다. 세포는 수시로 급속하게 생성하는 사이토카인을 분비하고, 사이토카인은 급속하게 인접한 세포에 의해 픽업됩니다. 그것은 장소에서 사이토 카인을 검출하는 것이 어렵다. 사이토카인 생산을 빠르게 재개시하는 일반적인 방법은 효소 연계 면역흡착 분석법에 의해 매체에서 사이토카인 검출에 이어 생체 내 세포를 재자극하는 것이다. 이러한 맥락에서, 사이토카인 생성 세포의 공간 국소화에 대한 모든 정보는 손실된다. 또한, 재자극 에 따른 사이토카인 생산은 시토카인이 실제로 생체 내에서 생산및 분비되는지 여부를 반드시 반영하지 않고, 오히려 사이토카인을 생산하는 주어진 세포 집단의 용량을 나타낸다. 따라서 두 방법 모두 서로 다른 정보를 제공하며 실험에 가장 유용한 정보를 고려해야 합니다.
세포내 사이토카인을 검출하기 위해, 우리의 방법은 세포 내부의 사이토카인을 포획하고 신호 검출을 증가시키기 위해 세포내 단백질 수송 억제제를 사용합니다. 그러나, 이 억제제는 내피 망상 (RE)에서 골지 장치및 그들의 방출을 손상시키는 분비 소포에 단백질의 일반적인 수송에 영향을 미친다는 것을 주의하는 것이 중요합니다, 이는 독성을 일으키는 원인이 될 수 있었습니다. 결과적으로, BFA, 또는 다른 억제제는, 단기간 동안, 전형적으로 몇 시간 이상 사용되어야 한다. 따라서, 심각한 세포 독성 효과를 일으키지 않고 세포 내부에 갇혀 있는 사이토카인의 수준을 최적화하기 위해서는 억제제 투여량과 치료 시간 사이의 적절한 균형을 찾는 것이 중요하다. 이러한 변수는 사이토카인과 BFA에 대한 투여 경로 간에 다를 수 있다. 우리의 감염 모델에서, BFA는 급속한 전신 분산을 제공하기 위하여 복강 내로 관리되었습니다, 그러나 또한 정맥으로 전달될 수 있습니다.
가장 일반적으로 사용되는 세포내 단백질 수송 억제제는 BFA, 여기에서 사용되며, 모넨신(MN)입니다. 이 억제제는 수시로 사이토카인 생산을 축적하고 공부하기 위하여 불분명하게 이용됩니다 그러나 행동의 그들의 기계장치에 있는 약간 다름이 있습니다. MN은 골지17에 단백질을 축적하는 골지 장치 내단백질의 수송을 억제하는 한편 BFA는 코아토머 단백질 복합체-I 모집을 방지하여 단백질의 역행이동을 억제하여 벤라세성 망상에 대한 단백질의 역행 이동을 억제한다(ER) ER18에서사이토카인의 축적을 촉진합니다. 이와 같이, 최적의 세포내 단백질 수송 억제제선택은 검출되는 사이토카인과 같은 상이한 인자에 의존할 것이다. 예를 들어, BFA가 MN19보다CYtokines IL-1β, IL-6 및 TNF를 측정하는 것이 더 효율적이라는 단핵구의 리포폴리사카라이드 유도 세포내 염색에 도시되었다.
이 프로토콜은 공초점 현미경 검사법에 의해 그 안에 있는 사이토카인의 시각화를 관련시키고 그러므로 사이토카인-생산 세포 및 그들의 미세 환경을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 보다는 마커의 단지 한정된 수가 있습니다. 또한 BFA 또는 MN과 같은 단백질 수송 억제제가 여러 단백질의 정상적인 발현을 방해하고 따라서 특정 활성화 세포 표면 마커의 동시 발현을 연구 할 때 그 사용이 접근되어야한다는 것을 고려할 필요가 있습니다. 주의깊게. 예를 들어, BFA는 MN이 아닌 뮤린 림프구(20)에서 CD69의 발현을 차단한다. 이러한 제한에도 불구하고, 공초점 이미징은 세포 내 사이토카인 분비의 방향뿐만 아니라 사이토카인의 하위 세포 국소화를 가능하게 한다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 데이터는 NK 세포가 확산 패턴으로 IFN-y를 분비하는 경향이 있는 반면 CD8+ T 세포는 IFNγ 분비를 그들과 직접 상호작용하는 다른 CD8+ T 세포쪽으로 지시하는 것으로 보인다는 것을 시사한다 5.
결론, 이 프로토콜은 그(것)들에서 다양한 사이토카인을 구상하고 감염 또는 자기 면역과 같은 많은 트리거다음 생성 세포 및 그들의 미세 환경을 확인하기 위하여 적당합니다. 얻어진 정보는 능률적인 면역 반응을 위해 필요한 다른 세포 모형 및 그(것)들이 생성하는 사이토카인의 생체 내 공간 오케스트레이션의 중요성을 이해하는 중요한 것입니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이미징기술 지원을 위해 케네디 연구소 이미징 시설 직원에게 감사드립니다. 이 작품은 케네디 트러스트 (A.G.) 및 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BB / R015651/1에서 A.G.)의 보조금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |||
| Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |||
| L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |||
| D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |||
| Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |||
| O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |||
| Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml | ||
| Microscope slides – Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |||
| anti-CD169 – AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
||
| anti-F4/80 – APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
||
| anti-B220 – PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
||
| anti-IFNg – biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml | ||
| anti-IFNg – BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
||
| anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/ml | ||
| anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
| Streptavidin – PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
||
| streptavidin – FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |||
| Cover glasses 22x40mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |||
| Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |||
| Imaris – Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||||
| Confocal microscope – Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||||
| Cryostat – CM 1900 UV | Leica | ||||
| Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |||
| PBS 1X | Life Technologies Ltd | 20012068 | |||
| BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |||
| GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||||
| RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||||
| Insulin syringe, with needle, 29G | VWR International | BDAM324824 | |||
| C57BL/6 wild type mice | Charles River |
Riferimenti
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