Listeria monocytogenes enfeksiyonu sonrasında Mouse dalağında In situ Interferon gama üretiminin görüntülenmesi
Summary
Burada, duvar ikincil lenfoid organlarda sitokin Interferon gama salgılama hücrelerin içinde situ lokalizasyonu görselleştirmek için basit bir Konfokal görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. Bu protokol, farklı dokularda diğer sitokinlerin görselleştirilmesi için uzatılabilir.
Abstract
Sitokinler, hücreler tarafından salgılanan küçük proteinlerdir, etkili immün tepkiler için önemli olan hücre hücresi iletişimlerini aracılık eder. Sitokinlerin bir özelliği, onlar tarafından üretilen ve hücre türlerinin çok sayıda etkileyebilir gibi onların pleiotropism olduğunu. Bu nedenle, sadece hangi hücrelerin sitokinleri üretirken değil, aynı zamanda daha spesifik terapilerinin tanımlanması için hangi ortamda yaptıklarını anlamak önemlidir. Burada, bakteriyel enfeksiyonun ardından situ içindeki sitokin üretimini görselleştirmenin bir yöntemini tarif ediyoruz. Bu teknik, Konfokal mikroskopiye göre kendi ortamlarında görüntüleme sitokin üreten hücrelere dayanır. Bunu yapmak için, doku bölümleri bir sitokin lekesi ile birlikte birden fazla hücre türlerinin belirteçleri için lekelenmiş. Bu yöntemin anahtarı, sitokin salgılanması, üretim hücrelerinin içinde birikmiş sitokin tespiti için izin, ilgi doku hasat önce doğrudan vivo engellenir. Bu yöntemin avantajları birden fazla. İlk olarak, sitokinlerin üretildiği mikroortam korunur, bu da sitokin üretimi için gerekli sinyalleri ve bu sitokinlerden etkilenen hücreler hakkında bilgi verebilir. Buna ek olarak, bu yöntem, üretim hücrelerinin yapay in vitro yeniden stimülasyon güvenmez olarak, in vivo sitokin üretiminin konumu bir göstergesi verir. Ancak, sitokin alan hücrelerde sitokin akım sinyalizasyon aynı anda analiz etmek mümkün değildir. Benzer şekilde, görülen sitokin sinyalleri yalnızca sitokin salgısı engellendiği zaman penceresine karşılık gelir. Biz hücre içi bakteri Listeria monocytogenes tarafından fare enfeksiyonu aşağıdaki dalak sitokin interferon (IFN) gama görselleştirme açıklayan iken, bu yöntem potansiyel olarak herhangi bir sitokin görselleştirme adapte olabilir çoğu organ.
Introduction
Bir patojene karşı etkili bir bağışıklık tepkisi düzenlemek, genellikle organizma arasında dağınık olan çeşitli immün hücreler tarafından görüntülenen sinyallerin karmaşık entegrasyonunu gerektirir. İletişim kurmak için bu hücreler, sitokinlerin adlı immünomodülatör olarak hareket eden birden fazla biyolojik fonksiyon ile küçük çözünür proteinler üretir. Sitokinler kontrol hücresi işe alma, aktivasyon ve proliferasyon ve dolayısıyla bağışıklık yanıtlarını promosyon anahtar oyuncular olduğu bilinmektedir1. Etkili immün tepkiler belirli sinyalleri teşvik etmek için belirli hücreleri bağlayan çok organize zamanmekansal desen serbest bırakmak için sitokinlerin gerektirir. Bu nedenle, sitokin üretimini ve situ içinde sinyalizasyon incelemek için çok önemlidir, dikkate alan hangi ksinlerin üretilen mikroçevre.
Ümit çakır (L. monocytogenes), farelerde hücre içi patojenlere bağışıklık yanıtlarının incelenmesi için bir asal model olarak kullanılan gram-pozitif hücre içi bir bakteridir. Bir sitokin, ıFN Gama (IFNγ) hızlı bir şekilde üretilir, L. monocytogenes enfeksiyonu sonrasında 24 saat içinde. Patojen boşluğu için gereklidir, farelerin IFNγ için yıkması L. monocytogenes enfeksiyon2‘ ye son derece duyarlıdır. Ifnγ pleiotropik ve enfeksiyon aşağıdaki birden fazla hücre tarafından üretilen3. Doğal katil (NK) hücreleri tarafından üretilen IFNγ doğrudan anti-bakteriyel aktivite için gereklidir4, diğer kaynaklardan ıfnγ diğer işlevlere sahip olduğu gösterilmiştir. Gerçekten de, biz ve diğerleri son zamanlarda bu ifnγ, CD8 + t hücreleri tarafından üretilen doğrudan T hücre farklılaşma5,6,7düzenleyen belirli bir işlevi vardır bulundu. Bu nedenle, hangi hücrelerin ıfnγ (ve hangi microenvironment) üretmek anlama fonksiyonunu incelemek için çok önemlidir.
Sitokin üretimini incelemek için en yaygın teknik, Akış sitometrisi tarafından analiz edilen hücre içi sitokin boyama üzerine dayanır. Bu yöntem, tek bir örnek içinde hücre yüzey işaretçileri ile birlikte birden fazla sitokinlerin eşzamanlı olarak algılanmasını sağlar, sitokin üretimini incelemek için son derece yararlı bir araç sağlamaktadır. Ancak, yukarıda belirtilen tekniği kullanarak herhangi bir uzamsal bilgi kaybetme anlamına gelir. Ayrıca, sitokin tespiti genellikle sitokin tespitini sağlamak için in vitro Re-stimulasyona dayanır. Bu nedenle, belirli bir hücrenin kapasitesi bir sitokin üretmek için analiz edilir ve mutlaka situ içinde gerçek sitokin salgılanması ile ilişkilendirmez. Diğer yöntemler, floresan protein ifadesinin sitokin transkripsiyonu ile ilişkili olduğu ve tek hücreli seviye8‘ de görselleştirmeye izin veren muhabir fareler kullanır. Bu yöntem situ içinde sitokin transkripsiyonu izleyebilse de, sınırlı sayıda sitokin muhabiri fareler mevcuttur. Buna ek olarak, transkripsiyon, çeviri ve salgılanma bazen bağlantısız olabilir, ve floresan proteinleri onlar rapor sitokin daha farklı bir yarı ömrü var, bu yöntem bazen situ sitokin görselleştirme için yeterli değil yapma.
Burada, tek hücreli çözünürlükte Konfokal mikroskopiye göre situ sitokin üretimini görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik doku içinde hücresel kaynak ve çevreleyen niş görselleştirme sağlar. Bu protokol özellikle L. monocytogenes enfekte fareler DALAĞıNDA, NK hücreleri ve antijen spesifik CD8+ T hücreleri tarafından ifnγ üretime odaklanan ınγ üretiminin görselleştirilmesini açıklar. Ancak, herhangi bir sitokin üretiminin karakterize edilmesi, sitokinlerin enfeksiyon, inflamasyon veya otoimmün hastalıklar gibi üretildiği diğer durumlar bağlamında, hedeflenen sittoin hücrelerde tutulabileceği sürece genişletilebilir ve uyarlanabilir hücre içi protein taşıma inhibitörü tarafından.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, farelerde L. monocytogenes enfeksiyonunun ardından dalak Içinde IFNγ üretimini görselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol basittir ve diğer dokular ve sitokin Tetikleyiciler adapte edilebilir, ancak aşağıdaki yönleri dikkate alınmalıdır. Hücreler genellikle hızla ürettikleri sitokinleri salgılar ve sitokinler komşu hücreler tarafından hızla toplanır. Situ içindeki sitokinlerin tespit edilmesi çok zordur. Sitokin üretimini hızla yeniden başlatmak için ortak bir yöntem, enzime bağlı İmmünosorbent assay ile medyada sitokin algılama takip hücreler ex vivo yeniden uyarmak için. Bu bağlamda, sitokin üreten hücrelerin uzamsal lokalizasyonu hakkında herhangi bir bilgi kaybolur. Ayrıca, yeniden stimülasyon sonrasında sitokin üretimi, sitokinlerin aslında üretilen ve salgılanmış olup olmadığını yansıtmaz, ancak belirli bir hücre nüfusunun sitokinleri üretmek için kapasitesini gösterir. Bu nedenle, her iki yöntem de farklı bilgiler sağlayacaktır ve bir deneme için hangi bilgilerin en değerli olduğunu düşünmelisiniz.
Hücre içi sitokinlerini tespit etmek için, yöntemimiz hücrelerin içindeki sitokinleri tuzağa düşürmek ve sinyal algılamasını artırmak için bir hücre içi protein taşıma inhibitörü kullanır. Ancak, bu inhibitörler proteinleri endotel retikulum (Re) Golgi aparatından normal taşıma etkiler ve salgın vezikül onların serbest zarar, hangi toksisite neden olabilir dikkat etmek önemlidir. Sonuç olarak, BFA veya diğer inhibitör, kısa bir süre için, genellikle birkaç saatten fazla kullanılmalıdır. Bu nedenle, ciddi sitotoksisik etkilere neden olmadan hücrenin içinde sıkışmış sitokinlerin seviyesini optimize etmek için inhibitör dozu ve tedavi süresi arasında doğru dengeyi bulmak önemlidir. Bu değişkenler sitokinler ve BFA için yönetim rotası arasında farklılık gösterebilir. Enfeksiyon modelimizde, BFA hızlı bir sistemik dağılım sağlamak için intraperitoneal yönetiliyordu, ancak aynı zamanda intravenöz olarak da teslim edilebilir.
En yaygın kullanılan hücre içi protein taşıma inhibitörleri BFA, burada kullanılan, ve monensin (MN). Bu inhibitörler genellikle sitokin üretimini birikmek ve incelemek için belirsiz bir şekilde kullanılır, ancak eylem mekanizmalarında hafif farklılıklar vardır. MN, Golgi cihazında proteinlerin taşınmasını inhibe eder, dolayısıyla Golgi17 ‘ de proteinleri birikir, BFA ise coatomer proteinlerinin kompleks-I işe alınmasını önler, proteinlerin endoplazmik retikulum ‘a retrograd hareketini inhibe eder (er) ve böylece ER18‘ de sitokinlerin birikmesini teşvik eder. Bu nedenle, en iyi hücre içi protein taşıma inhibitörü seçimi farklı faktörlere bağlı olacaktır, tespit edilecek sitokin gibi. Örneğin, monositlerin lipopolysaccharide kaynaklı hücre içi boyayırken, BFA ‘nın Il-1β, IL-6 ve TNF ‘yi MN19‘ dan daha ölçmek için daha verimli olduğunu göstermiştir.
Bu protokol, cytokin ‘in situ içinde, Konfokal mikroskopi ile görselleştirilmesini içerir ve bu nedenle sitokin üreten hücreleri ve mikroortamlarını incelemek için kullanılabilir olandan sadece sınırlı sayıda marker vardır. Aynı zamanda, BFA veya MN gibi protein taşıma inhibitörlerinin çeşitli proteinlerin normal ifadesini rahatsız etmesini ve dolayısıyla belirli aktivasyon hücresi yüzey işaretleyicilerinin eşzamanlı ifadesinin incelenmesi sırasında kullanımı konusunda dikkat edilmesi gerekir Dikkatle. Örneğin, BFA ama MN blokları CD69 murine lenfositler20ifade. Bu sınırlamalara rağmen, konfeti görüntüleme, sitokinlerin alt hücresel lokalizasyonunu ve hücre içindeki sitokin salgılanması yönünü sağlar. Bu protokol kullanılarak oluşturulan veriler, NK hücrelerinin bir differe desen IFN-y salgılaşmaya eğilimindedir önerirken CD8+ t hücreleri gıbı diğer CD8+ t hücrelere karşı ifnγ salgılanmasını doğrudan görünüyor onlarla doğrudan etkileşim5.
Sonuç olarak, bu protokol situ içinde çeşitli sitokinlerin görselleştirmek ve enfeksiyon veya otoimmünite gibi birçok Tetikleyiciler aşağıdaki hücreler ve mikroçevre üreten tanımlamak için uygundur. Elde edilen bilgiler, etkili bir bağışıklık tepkisi için gerekli olan farklı hücre türlerinin ve ürettikleri sitokinin in vivo uzamsal orkestrasyonun önemini anlamak için önemlidir.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz görüntüleme ile teknik yardım için Kennedy Enstitüsü görüntüleme tesisi personeli teşekkür ederiz. Bu çalışma Kennedy Trust (A.G.) ve Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BB/R015651/1 için A.G.) tarafından hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |||
| Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |||
| L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |||
| D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |||
| Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |||
| O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |||
| Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml | ||
| Microscope slides – Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |||
| anti-CD169 – AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
||
| anti-F4/80 – APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
||
| anti-B220 – PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
||
| anti-IFNg – biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml | ||
| anti-IFNg – BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
||
| anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/ml | ||
| anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
| Streptavidin – PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
||
| streptavidin – FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |||
| Cover glasses 22x40mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |||
| Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |||
| Imaris – Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||||
| Confocal microscope – Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||||
| Cryostat – CM 1900 UV | Leica | ||||
| Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |||
| PBS 1X | Life Technologies Ltd | 20012068 | |||
| BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |||
| GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||||
| RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||||
| Insulin syringe, with needle, 29G | VWR International | BDAM324824 | |||
| C57BL/6 wild type mice | Charles River |
Riferimenti
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Kubota, K., Kadoya, Y. Innate IFN-gamma-producing cells in the spleen of mice early after Listeria monocytogenes infection: importance of microenvironment of the cells involved in the production of innate IFN-gamma. Frontiers in Immunology. 2 (26), (2011).
- Dunn, P. L., North, R. J. Early gamma interferon production by natural killer cells is important in defense against murine listeriosis. Infection and Immunity. 59 (9), 2892-2900 (1991).
- Krummel, M. F., et al. Paracrine costimulation of IFN-gamma signaling by integrins modulates CD8+ T cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), 11585-11590 (2018).
- Curtsinger, J. M., Agarwal, P., Lins, D. C., Mescher, M. F. Autocrine IFN-gamma promotes naive CD8+ T cell differentiation and synergizes with IFN-alpha to stimulate strong function. Journal of Immunology. 189 (2), 659-668 (2012).
- Hosking, M. P., Flynn, C. T., Whitton, J. L. Antigen-specific naive CD8++ T cells produce a single pulse of IFN-gamma in vivo within hours of infection, but without antiviral effect. Journal of Immunology. 193 (4), 1873-1885 (2014).
- Croxford, A. L., Buch, T. Cytokine reporter mice in immunological research: perspectives and lessons learned. Immunology. 132 (1), 1-8 (2011).
- Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8++ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. Journal of Visualized Experiments. (9), 409 (2007).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. Journal of Visualized Experiments. (7), 265 (2007).
- Pope, C., et al. Organ-specific regulation of the CD8+ T cell response to Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 166 (5), 3402-3409 (2001).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance. Current Protocols in Microbiology. 31, 1-7 (2013).
- Kang, S. J., Liang, H. E., Reizis, B., Locksley, R. M. Regulation of hierarchical clustering and activation of innate immune cells by dendritic cells. Immunity. 29 (5), 819-833 (2008).
- Chang, S. R., et al. Characterization of early gamma interferon (IFN-gamma) expression during murine listeriosis: identification of NK1.1+ CD11c+ cells as the primary IFN-gamma-expressing cells. Infection and Immunity. 75 (3), 1167-1176 (2007).
- Mollenhauer, H. H., Morre, D. J., Rowe, L. D. Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1031 (2), 225-246 (1990).
- Helms, J. B., Rothman, J. E. Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF. Nature. 360 (6402), 352-354 (1992).
- Schuerwegh, A. J., Stevens, W. J., Bridts, C. H., De Clerck, L. S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes. Cytometry. 46 (3), 172-176 (2001).
- Nylander, S., Kalies, I. Brefeldin A, but not monensin, completely blocks CD69 expression on mouse lymphocytes: efficacy of inhibitors of protein secretion in protocols for intracellular cytokine staining by flow cytometry. Journal of Immunology Methods. 224 (1-2), 69-76 (1999).
