1 차 인간 기도 상피 세포의 기도 표면 액체 pH의 실시간 반 자동화 형광 측정

1 차 비 F580del 기증자, 나이 34, 27 세 및 F508del) 및 40, 41에 해당 하는 경우에는 미국 노스캐롤라이나 대학교의 스 캇 에이치 란 젤 박사에서 일종의 선물이 됐다. 오 타이, 채 플 힐에서 노스 캐롤라이나 대학에 도착 한 ‘ 하이 코 ‘ 프로토콜에 따라 ned #03-1396는 채 플 힐 의료 기관 검토 위원회에서 노스 캐롤라이나 대학에 의해 승인. 상기 세포는 fulcher 및 란 겔35,36에 의해 기술 된 성장 및 분화 배지를 이용 하 여 이전에 출판 된 방법에 따라 성장 하였다. 1. 샘플 준비 앞서 설명한35,36에 따라 최소 28 일 동안 공기 액체 인터페이스에서 6.5 mm 반투과성 지지대 (재료 표)를 기본 haecs로 성장 시킵니다. Hco 3 함유 크 렙 스 완충 용액 에 50 mL의 멸 균 용액을 제조 하였다 (hco 3krb) 염화 나트륨 (115) , cacl 2(11), mgcl 2(1), 디 글 루 코 티 드 (5 ) 및 필터-0.2 μ m 주사기 필터를 사용 하 여 살 균 합니다. 1.135,36에 기재 된 바와 같이 basolateral 배지를 신선한 분화 배지로 변경 한다.참고: basolateral 글루코스 농도가 ASL pH33에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 이 단계에서, basolateral 구획의 글루코스 함량은 알려진 글루코스 농도의 완충 용액에 의해 배지를 대체 함으로써 제어 될 수 있다. Hco3- krb의 150 µ l을 추가 하 여 세포의 근 면 표면을 세척 하 고 37 ° c에서 20 분 동안 배양 합니다. 멸 균 유리 파스퇴르 pipet 및 수집 병에 진공을 만드는 흡 인 펌프에 연결 된 멸 균 P200 pipet 팁을 사용 하 여 조심 스럽게 흡입 하 여 상피를 방해 하지 않고 애 피 컬 세척을 제거 합니다. 이 단계에서 공기 액체 인터페이스를 복원 하기 위해 가능한 한 약간의 액체가 남아 있어야 합니다. 37 ° c, 5% CO2에서 추가로 30 분 동안 세포를 배양 한다. 2. 배경 측정 플레이트 리더 및 컴퓨터를 켭니다. 대시보드를 엽니다. 10M 스파크를 클릭 하 고 온도 제어를 열고 37 ° c로 설정 합니다. 가스 제어를 열고 CO2를 5% 로 설정 합니다. 온도와 CO2가 목표 에 도달 할 때까지 기다리십시오. 플레이트 리더 서랍을 열고 각 측면에 dH 2o의 6ml로 채워진습도 카세트를 삽입 하십시오. 플레이트의 뚜껑과 바닥이 깨끗 한지 확인 하십시오-그렇지 않다면, 70%의 에탄올을 티슈에 넣고 깨끗 하 게 하 고, 플레이트를 습도 카세트에 놓습니다.참고: 실험 전반에 걸쳐, 조직 배양 판 뚜껑은 약 제를 첨가 하거나 basolateral 배지를 변경 하는 경우에만 제거 하 고, 조직 배양에서 수행 되는 층 류 후드를 멸 균 환경에서 배양 하 여 유지 한다. Spark 메서드 편집기를 열고 다음과 같이 소프트웨어에 대 한 매개 변수를 설정 합니다. 적절 한 플레이트 템플릿을 선택 합니다 (6.5 mm 반 투과성 지지대의 경우 24 웰 플레이트를 선택 하 고이 실험 중 모니터링 되는 웰). 온도 및 CO2 제어 패널 을 추가 하 고 각각 37 ° c 및 5%로 설정 합니다. 온도/가스 상자에 대 한 대기 를 체크 합니다. 키네틱 루프 패널을 추가 하 고 루프 유형으로 지속 시간을 선택 하 고 5-10 분으로 설정 합니다. 연속 읽기를 사용 하려면 간격 유형으로 정의 되지 않음을 선택 합니다.참고: 연속 판독의 타이밍은 웰/조건의 수에 따라 달라 집니다. 5 분은 6-12 우물을 위해 충분히 긴 반면, 24 조건을 포함 하는 전체 판은 연속 측정의 10 분이 필요 합니다. 운동 루프 내에서 드래그 앤 드롭 기능을 사용 하 여 두 개의 “형광 강도” 패널을 추가 하 고, ph 민감성 및 pH 민감 하지 않은 형광 염료를 각각 설정 합니다. 상기 ph 민감성 염료 및 495 및 520 nm 각각에 대해 여기 및 방출 파장을 560 및 590 nm로 각각 설정 하 여 pH에 민감 하지 않은 염료를 들 수 있다. 플래시의 수를 30으로 설정 하 고 각 형광 단에 대해 z 위치를 33200 합니다.주: z 위치 및 게인 설정은 플레이트 리더의 특성에 따라 달라 집니다. 게인을 수동으로 설정 하 여 샘플 간의 차이가 포착 될 수 있을 만큼 충분히 높은 값을 제공 하지만, 주 작동 근의 추가가 감지 범위를 벗어난 값을 생성 하지 않도록 충분히 낮습니다. 4750 µm의 테두리와 함께 3 × 3 크기의 원 유형으로 정의 된 사용자에 게 한 우물 당 다중 판독을 설정 합니다. 시작 단추를 클릭 하 여 배경 측정을 수행 하 고 확인을 통해 습도 카세트의 뚜껑이 제자리에 있는지 확인 합니다. 측정의 끝에서, 플레이트 리더 서랍을 열고, 플레이트 밖으로 가져와 서, 형광 염료 혼합 용액을 제조 하는 동안 배양 기에 다시 세포 시트를 Pplace. 상기 형광 염료 혼합 용액을 1 mg/ml 덱 스 트 란 결합 된 ph 감 응 (phsens) 형광 염료 0.2 µ l의 10mg/ml 덱 스 트 란 결합 ph에 민감 하지 않은 (phsens) 형광 염료 및 0.8 µ l의 멸 균 hco3- krb를 첨가 하 여 제조 된 최종 조건 당 3 µ L의 부피.참고: 염료 혼합 용액의 총량은 1 ~ 10 개의 샘플이 있는 경우 엔 웰 스 + 1에 대해 준비 되어야 하며, 11 개 및 24 개의 샘플이 있는 경우에는 n 우물 + 2가 있어야 합니다. 덱 스 트 란 결합 염료는 여과 된 멸 균 hco3- krb 용액으로 재구성 되 고,이는-20°c에서 저장 된다. 임의의 화학 물질이 애 피 컬 표면에 16-24 h 인큐베이션 기간37 에 대해이 단계에서 추가 될 수 있다. 화학 물질은 0.1 x로 제조 되어야 하며, 최종 부피는 배양에 의해 과량의 유체의 흡수 후, 6.5 mm 반 투과성 지 지체를 위한 0.3 µ L 부근에 있을 것 이다. 3 µ의 염료 믹스 (2.8 참조)를 세포의 근 표면에 조심 스럽게 추가 하 고 37 ° c, 5% CO2에서 밤새 배양 한다. 3. 운동 측정 2.1 ~ 2.4 단계를 반복 하 여 플레이트 리더를 준비 합니다. 열기 아이콘을 클릭 하 고 배경 측정에 사용 되는 방법 파일을 선택 합니다. 키네틱 루프 패널에서 루프 유형을 지속 시간으로 유지 하 고 08 시간으로 설정 합니다. 간격 유형을 고정으로 변경 하 고 5 분으로 설정 합니다. 형광 강도 패널을 배경 측정과 동일 하 게 유지참고: 백그라운드 측정을 위한 간격 유형은 연속 읽기를 허용 하기 위해 “정의 되지 않음”으로 설정 됩니다. 운동 뿐만 아니라 교정 실험의 경우, 간격 유형은 5 분 간격으로 “고정”으로 설정 됩니다. 이는 실험의 설계와 조건의 수에 따라 조정 될 수 있다. 플레이트 리더 서랍을 엽 니 다; 각 면에는 dH 2o의 6ml로 채워진 습도 카세트를 넣습니다. 플레이트의 뚜껑과 바닥이 깨끗 한지 확인 하십시오-그렇지 않은 경우 티슈에 70% 에탄올로 청소 하 고 뚜껑을 덮고 습기 카세트에 플레이트를 놓습니다. 시작을 클릭 하 여 형광 판독값을 시작 합니다. 습도 카세트의 뚜껑이 제자리에 있는지 확인 한 후 OK 를 클릭 합니다. 일반적으로 1 ~ 2 시간에 해당 하는 n 싸이 클이 12 ~ 24 일 후 일시 중지 를 클릭 하 여 실험을 중단 합니다. 플레이트를 꺼내 다른 샘플에 대 한 모든 약물/촉진제를 적용 합니다.참고: 세포가 플레이트 리더에서 꺼내어 지 면, CO2는 pH 민감성 염료 형광에 의해 나타난 바와 같이 ASL ph의 증가를 유도 합니다. 이 CO2유도 pH 변화는 배양 물을 플레이트 리더에 다시 배치한 후 10-15 분 이내에 역전 됩니다. 접시를 트레이에 있는 습기 카세트에 다시 놓고, 습도 카세트 뚜껑을 재배치 하 고, ASL pH를 더 기록 하 고, ASL ph에 대 한 약물/작용 제의 효과를 모니터링 하기 위해 계속 을 클릭 합니다. 4. 현장 pH 교정 플레이트 리더에서 플레이트를 꺼내 세요. Basolateral 매체/용액을 흡입 합니다. Basolateral 구획과 애 피 컬 표면에 각각 고도로 버퍼링 된 표준 곡선 솔루션의 750 µ l 및 1 µ l을 추가 합니다.주: 고도로 버퍼링 된 표준 원 곡선 솔루션은 86), CaCl2(1.2 1.2), 내 헵 또는 MES 또는 스 트리 스 100 (5mm)를 포함 합니다. MES를 사용 하 여 ph가 7 미만인 용액을 완충 하 고 ph 7-7.5 및 트리 스를 pH 8로 솔루션에 대 한 Na헵. HCl을 사용 하 여 pH를 원하는 값으로 고정 합니다. 평판 판독기에서 co2를 끄거나 0.1%로 설정 하 고 플레이트를 습도 카세트에 다시 놓습니다. 앞에서 설명한 것과 동일한 매개 변수를 사용 하 여 플레이트 판독기를 설정 하 고 3.2 단계에서와 같이 CO2 를 사용 하지 않습니다. 1-1.5 시간 동안 5 분 마다 형광 판독값을 시작 합니다. 5. 보정 데이터에 대 한 염료 농도 및 서 스 펜 션 부피의 효과 평가 3 가지 용적에서 최소 4 가지 pH 값으로 형광을 기록 하기에 충분 한 pH 민감성 및 민감 하지 않은 염료 혼합물을 준비 하십시오.참고: 여기에서, 혼합 1은 µ의 pH 민감성 (1mg/ml) 및 2.6 µ L의 ph 민감성 (10mg/ml)을 혼합 하 고, ph 감 응 형 (1mg/ml)의 13µ L 및 1.3 µ L을 섞어 2 개를 제조 하였다. 2.2 µ L 또는 1.1 µ L을 혼합 1 또는 혼합 2, 각각 96 웰 플레이트의 12 웰에 넣고 충분 한 교정 솔루션을 추가 하 여 50, 100 또는 200 µ L의 최종 볼륨을 얻고 잘 섞어 줍니다.참고:이 설정에서 형광 계수는 5µ의 염료 농도 (200 µ L), 10µ에서 100 또는 200 µ L) 또는 50 또는 100 µ L) 또는 40 µ g/ml(50 µ L)에 대해 기록 될 것입니다. 평판 판독기를 켠 후 온도를 37 ° c로 설정 하 고 플레이트 리더에 플레이트를 삽입 합니다. CO2 컨트롤러를 켜지 마십시오.참고: 이것은 짧은 실험 이며 온도를 평형 화 하기에 충분 한 시간을 필요로 하기 때문에, 습도 카세트는 필요 하지 않습니다. 96 well 플레이트의 z 위치와 게인을 조정 하 고 반 투과성 지지대에서 수행 된 실험과 동일한 매개 변수를 사용 합니다. 6. 데이터 분석 모든 데이터를 스프레드시트에 저장 하 고 새 파일을 만듭니다. 배경 파일에서 두 파장의 각 샘플/조건에 대 한 모든 평균 데이터를 선택 하 고 복사 하 여 새 파일에 붙여넣습니다. 각 우물과 각 파장에 대 한 평균 배경을 계산 합니다. 보정 및 키네틱 데이터를 사용 하 여이를 반복 하 고 각 파장에 대 한 각 데이터 포인트에서 배경을 뺍니다. 각 시간 점과 모든 시료에 대해 pH 민감성과 pH에 민감 하지 않은 형광 사이의 비율을 계산 합니다. 개별 기증자 로부터 모든 샘플을 얻은 경우, 보정 곡선의 각 시점에서 비율의 평균을 계산참고: 기부자 또는 basolateral 솔루션으로 많은 교정 곡선을 생성 하는 것이 중요 합니다. 실제로, 이러한 매개 변수는 차례로 염료 농도 및 계산 된 pH에 영향을 미칠 것 이다 유체의 흡수 속도 또는 배경 판독에 영향을 미칠 수 있다. 각 시간 점에 대해 비율에서 표준 곡선을 생성 하 여 x 축에 알려진 pH 값과 y 축의 비율을 플로팅 합니다. 비율이 안정 되는 시점을 결정 하 고 선형 회귀 선을 피팅 하 고이 선에 대 한 방정식을 구합니다. 운동 데이터 로부터, 각 시점에 대 한 pH를 계산 하 고 y 축에 pH를 x 축의 시간에 플로팅합니다.주: 휴식/기저 pH는 작용 제 또는 기타 개입의 추가 전에 pH의 안정적인 측정을 통해 데이터 포인트를 평균화 하 여 계산할 수 있습니다. 작용 제의 효과는 처리 전 및 후의 pH 차이를 계산 하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 개입 직후에 데이터 포인트에 비선형 곡선을 피팅 하 여도 된다. 이렇게 하면 t1/2 및 최대값에 대 한 추가 정보가 제공 됩니다. 최종적으로, 산성화 또는 알칼리 화의 비율은 또한 개입 후 첫 번째 지점에 장착 직선의 기울기 로부터 얻을 수 있다.