初代ヒト気道上皮細胞の気道表面液 pH をリアルタイムで半自動で蛍光測定

上述の技術は、最大24の別々のプライマリ hAECs 培養における ASL pH の動的測定を可能にします。図 1に、主な手順と設備の概略図を示します。一晩ロードされた細胞は、抗デキストラン結合された ph 感受性および ph 非感受性染料からの蛍光を5分毎に記録した co2 および温度制御プレートリーダーに置かれる。 図 1: ASL pH 測定法の概略培養物を洗浄してバックグラウンドでの読み取りを行った後、初代ヒト気道上皮細胞 (hAECs) ASL は、37° c、5% CO2 で一晩中 pH 感受性および pH 非感受性色素の混合デキストランを結合して装填される。次の日に、プレートは、温度および CO2 制御プレートリーダーに移し、両染料からの蛍光が経時的に記録される。実験の後、in situ キャリブレーションを実行し、データを分析し、時間の経過とともに ASL の pH として提示します。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 最初に、蛍光カウントに対する異なる体積および色素濃度の影響、したがって560/495 比について調べた。実際に、pH 感受性染料に対する pH 非感受性を加える目的は、ASL のローディングにおける変動性のために修正することである。しかし、この仮定をテストし、すべての実験と細胞の種類の96ウェルプレートの細胞が存在しない場合に実行される標準的な較正曲線を使用できるかどうかを評価することが重要でした。50、100または200μ l の較正溶液 (pH 5.5、6.5、7または 8) での蛍光カウントを5、10、20、または40μ g/mL の染料でモニタリングしました。結果は図 2a-Cに示されており、同一の pH および同濃度の染料については、報告される pHsens/pHins の発光比 (y 軸上の 560/495) が体積に応じて異なっていることを示している (図 2a)。さらに、同じ pH および同じ容積で、異なる色素濃度は異なる比値を提供する (図 2b)。したがって、体積または染料濃度の変化は、放出比から計算された pH の絶対値に影響を与える。図 2cは、温度平衡に必要な時間が約15-20 分であることを示しています。色素濃度と体積が発光比に及ぼす影響を確認するために、一次非 CF および CF hAECs の ASL に装填された染料から蛍光を記録した。次に、キャリブレーションを実行し、(1) すべてのサンプルから1つのグローバル標準曲線を生成するか、(2) 各セルタイプ (非 CF および CF) に対して2つの独立した標準曲線を生成することにより、結果を分析しました。両方のセルタイプからの ASL pH は、その後、時間に対してプロットされました (図 3a、B) と平均 (図 3c)。単一のグローバルな標準曲線から得られた asl の ph 値は、非 cf と cf の培養 (図 3a、C) の間に有意な差を示したのに対し、asl の ph は、ph を計算したときの cf と非 cf hAECs の間で有意に異なっていなかった独立した標準曲線 (図3b、C)。これらの結果は、それぞれの実験のために、実験の間に独立した較正曲線を生成することの重要性を示し、各ドナーサンプルについて、較正曲線が一緒に平均化されたときから、より高い pHsens/pHins 比値が CF 培養物に見出された、より酸性 pH を示す (図 3c)。 図 2: インビトロでの pH 較正の最適化。既知の pH および異なる色素濃度の溶液の異なる容積を96ウェルプレート上に装填し、蛍光を1時間にわたって記録した。体積 (a) および色素濃度 (B) の蛍光比への影響。比は、時間−ポイント24分について pH に対してプロットした (C) 蛍光の変化の傾きを各溶液について計算し、時間の関数としてプロットした (min)。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 3: 一次 hAECs の pH 較正の分析を現場で最適化する。(A) 単一の標準曲線から得られた ASL pH の代表的な痕跡で、非 CF および cf 培養からのデータを平均化する。(B) 非 CF または cf 培養で実行された独立した標準曲線から得られる ASL pH の代表的な痕跡。各データセットは、独自の較正曲線から計算されました。(C) キャリブレーションがどのように行われたかの関数としての非 CF および cf 培養間の ASL pH の差の評価。データは、n = 3 実験からの平均± SEM、2ウェイ ANOVA、Sidak の多重比較検定) を表す。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 さらに我々の技術を検証するために、我々は、技術が ASL pH の「予想される」変化を検出することができることを実証するためにポジティブコントロールを必要としました。CF 細胞におけるより酸性の ASL の存在はまだ論争しているように、我々は CFTR を介して HCO3分泌を刺激するために、ポジティブなコントロール条件として、収容所アゴニストフォルスコリンを使用しました。期待される結果は、変異の重症度に応じて、CF 細胞で主に減少または廃止される非 CF 細胞において、フォルスコリンによって引き起こされた足しの ASL を示しています。図 4aは、時間の経過に伴う非 CF および cf 細胞の asl ph の代表的な痕跡を示し、図 4bは、両方の細胞タイプでフォルスコリンで処理する前後の asl ph の平均データを示しています。これらの結果から異なる情報を得ることができます。第1に、図 3bに既に示したように、C、安静 ASL pH は非 CF と cf 上皮とで異なっていなかった。第2に、フォルスコリンで細胞を治療するために実験を一時停止した後の最初の3-4 タイムポイントは、〜15分以内に回収された pH の大きな増加を示した。これは、プレートリーダー間の CO2濃度の低下によるものであった (5%)そして組織培養安全キャビネット (~ 0%)。ヘンダーソンハッセルバルヒの方程式によれば、5% co2 環境中の pH が7の HCO は、3 ~ 9.3 mM の濃度に相当します。細胞がプレートリーダーから除去されると、CO2 濃度が 0 % に低下すると、理論的には > 8 の pH の上昇につながります。図 4aに、ASL pH が〜7.8 に増加したことを示しており、これは、プレートリーダー内でプレートを再配置する時間の経過によって説明することができる (すなわち、 5% co2 環境における)。最後に、予測されたように、basolateral 10 μ m フォルスコリン (Fsk) の添加は、非 CF 培養において ASL pH を有意に増加させた。CF と非 CF 上皮間の定常的な ASL の pH に違いが存在することが異なるグループによって示されているので、我々はさらに我々の実験と CFTR の役割の pH 差の明らかな欠如を調査したかった。これを行うために、特定の CFTR 阻害剤である非 CF 培養物をプレインキュベーションした、CFTRinh172 (172)。プロトコルセクション2.8 に記載されているように、染料混合物を上記のように調製し、0.1 X = 2 μ m の濃度で阻害剤を添加した。文献によると、非 CF 細胞の ASL の高さは、約10μ m である。6.5 mm 直径の半透過性のサポートでは、ASL の理論体積はπ× 3.252 = 0.3 μ l です。2μ m で染料 + 172 の3μ l を添加することにより、阻害剤の濃度は、過剰な流体の吸収後、理論的には20μ m (1x、所望の濃度) となる。図4cの代表的なトレースと図 4dの平均要約は、172が安静時の asl の ph を低下させなかったが、フォルスコリンが asl の ph の上昇を抑制し、したがって非 cf対cf から得られた結果を確認したことを示しています。文化を、さらに我々の技術を検証します。 図 4: フォルスコリンによる CFTR 活性化に対応した動的 ASL pH 測定。(A) フォルスコリンの効果の代表的な痕跡 (Fsk, 10 μ m) 非 CF および cf hAECs で時間をかけて ASL pH の動態に.データは n = 3 実験からの平均± SEM を表す。(B) 非 CF および cf 培養における ASL pH に対する Fsk の影響の要約データは、n = 69 非 CF 培養物からの平均± SD および 35 CF 培養物を表す (2 ウェイ分散分析、Sidak の多重比較検定)。(C) 非 CF hAECs における ASL pH における Fsk 誘発性のinh172 (172、20μ m) の効果の代表的な痕跡。データは n = 5 実験からの平均± SEM を表す。(D) 非 CF 培養における足しの Fsk 誘導性に対する172の効果の概要データは n = 5 実験からの平均± SEM を表す (2 ウェイ ANOVA、Sidak の多重比較検定)。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 最後に、プロトコルセクション6.8 に記載されているように、酸性化/アルカリ化の割合は、介入後の初期の時間点に線形回帰を当てはめることによって計算することができる。図 5a は、basolateral HCO3含有溶液 (HCO3- KRB) を除去して HEPES 緩衝溶液に置き換えることを示し、co2 の非存在下で、ASL の著しい酸性化を誘発した。これは、HCO3阻害経上皮 HCO3分泌の欠如と一致し、これらの気道細胞による恒常的なプロトン分泌が着実に ASL の pH15, 17を減少させる。興味深いことに、非 CF 細胞の初期の酸性化率は、CF 培養よりも有意に遅かった (図 5b)。 図 5: HCO3-除去に応答して ASL pH の動的変化。(A) 非 cf および cf hAECs の経時的な ASL pH の動態に HCO3除去の効果を示す代表的なトレース。酸性化の初期速度は、HCO3-除去後7時間点に嵌合した直線の傾きを介して得られた。データは、それぞれ非 CF および CF 培養における n = 6 および7実験からの平均値± SEM を表す。(B) HCO に続く酸性化の初期速度の要約3-除去。データは、それぞれ非 CF 及び CF 培養に対する n = 6 及び7実験からの平均値± SEM を表す (マン・ホイットニー検定)。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。