一次人气道上皮细胞气道表面液体 pH 值的实时、半自动荧光测量

初级非合作框架 (n = 3个捐助方, 34岁、27岁和23岁的人和 CF (n = 3个捐献者, 所有 F580del/F508del; 40岁, 41岁, 不知道) Haec 是 Scott h. randell 博士 (美国北卡罗来纳大学教堂 Marsico Lung 研究所) 送给他的礼物, 而且是 obtai根据议定书 #03-1396 批准北卡罗来纳大学教堂山生物医学机构审查委员会。这些细胞是根据以前公布的方法使用 fulcher 和 randell 35,36描述的生长和分化介质生长的。 1. 样品制备 如上文所述,在空气-液体界面的6.5 毫米直径半渗透支撑物 (材料表) 上生长至少 28天. 制备50毫升的 hco3-含krebs 缓冲液 (hco 3-krb,浓度为 mL nhaco3 (25)、kcl (5)、cal 2 (1)、mgcl 2 (1)、 d-1 glucose(5)和过滤消毒使用0.2μm 注射器过滤器。 如 1.135、36所述, 将底外侧培养基转化为新鲜分化培养基。注: 已证明, 基底外侧葡萄糖浓度影响 ASL ph 33.在这一阶段, 可以通过使用已知葡萄糖浓度的缓冲溶液来控制基外侧隔间的葡萄糖含量。 在37°c、5% co 2 下加入150μl 的 hco3-krb , 孵育 20分钟, 将细胞的顶部表面清洗干净. 使用无菌玻璃巴斯德管和连接到抽吸泵的无菌 P200 管头, 在收集瓶中产生真空, 在不干扰上皮的情况下取出顶部清洗液, 而不会干扰上皮。在这个阶段, 顶端表面应该有尽可能少的液体来恢复空气-液体界面。 在37°c、5% CO 2 下再培养细胞30分钟。 2. 背景测量 打开读卡器和电脑。 打开仪表板。 点击星火 10M, 打开温度控制, 设置为37°c。打开气体控制, 并将 CO 设置为2% 至5%。 等到温度和二氧化碳达到目标. 打开读卡器抽屉, 在两侧插入充满6毫升 Dh2o的湿盒。确保盘子的盖子和底部是干净的–如果没有, 用70% 的乙醇在一块纸巾上清洗–并将盘子放在湿度盒里。注: 在整个实验过程中, 组织培养板盖被保存在板上, 只有在添加药物或改变基外侧培养基时才将其取出, 这些培养基在组织培养层状流罩中进行, 以保持培养物处于无菌环境中。 打开 Spark 方法编辑器, 并在软件上设置参数, 如下所示: 选择合适的板模板 (对于 6.5 mm 直径的半渗透支承, 选择24井板) 和将在本实验期间进行监测的井。 添加温度和 CO2控制面板, 并将其分别设置为37°c 和5%。勾选温度煤气箱的等待。 添加一个动能循环面板, 并选择 “持续时间” 作为循环类型, 并将其设置为 5-10. 选择 “未定义为间隔类型” 以启用连续读取。注: 连续读取的时间取决于井/条件的数量。5分钟足够长的6-12 口井, 而包含24个条件的完整板将需要10分钟的连续测量。 在动力学循环中, 使用拖放功能添加两个 “荧光强度” 面板, 分别用于 ph 敏感染料和 pH 敏感荧光染料。将 ph 敏感染料的激发和发射波长分别设置为560和590纳米, 对 ph 不敏感染料的激发和发射波长分别设置为495和 520 nm。 将每个荧光体的闪烁次数设置为 30, 将 z 位置设置为33200。注: z 位置和增益设置取决于板式读取器的特性。手动将增益设置为一个值, 该值将提供足够高的计数, 以便拾取样本之间的差异, 但足够低, 以便添加激动剂不会产生超出检测范围的值。 将每个井的多读设置为定义为边框为4750μm 的3×3 大小的圆型。 单击 “开始” 按钮进行背景测量, 然后确定以确认湿度盒的盖子已就位。 测量结束后, 打开盘子读取器抽屉, 取出盘子, 将细胞放回孵化器, 同时准备荧光染料混合溶液。 将2μml 的1mgml 右旋偶联 ph-敏感 (phsens) 荧光染料添加到0.2μml 的10μml 糊代偶联 ph-不敏感的磷化蛋白 (phins) 荧光染料和0.8μl 无菌 hco 3-krb 的荧光染料混合溶液进行最终的制备每个条件的体积为3μl。注: 如果有1至10个样品, 则应为 n 井 + 1 制备染料混合溶液的总体积; 如果有11至24个样品, 则应准备 n 井 + 2。糊精偶联染料在过滤无菌 hco 3-krb 溶液中重组, 在-20°c 下进行和储存。在此阶段, 任何化学品都可以在顶端表面添加16-24 小时的潜伏期37 。化学品的制备应为0.1 倍, 因为最终体积在培养后吸收多余的液体后, 将在0.3μl 左右, 用于6.5 毫米直径的半渗透支撑物。 小心地将3Μl 染料混合物 (见 2.8) 添加到细胞的顶端表面, 在37°c、5% CO2 处孵育过夜。 3. 动能测量 重复步骤2.1 至 2.4, 准备板式读取器。 单击 “打开” 图标, 然后选择用于背景测量的方法文件 在动力学循环面板中, 将环路类型保持为 “持续时间”, 并将其设置为08小时。将 “间隔” 类型更改为 “固定”, 并将其设置为5分钟。保持荧光强度面板与背景测量相同注: 背景测量的间隔类型设置为 “未定义”, 以允许连续读取。对于动力学和校准实验, 间隔类型设置为 “固定”, 间隔为5分钟。这可以根据实验的设计和条件的数量进行调整。 打开读卡器抽屉;在每侧插入充满 Dh2o6毫升的湿盒。确保盘子的盖子和底部是干净的–如果没有, 用70% 的乙醇在一块纸巾上清洗–并将盘子放在带有盖子的湿盒里。 点击”开始”开始荧光读数。确保湿度盒盖就位后, 单击”确定” 。 N 周期后, 通常在12到24之间, 这相当于 1到2小时, 单击 “暂停”以中断实验。取出盘子, 并应用任何药物/激动剂玄武岩横向对不同的样品。注: 当细胞从板式读取器中取出时, CO2会逃逸, 这将导致 Asl ph 值的增加, 如 ph 敏感染料荧光的下降所示。这种二氧化碳诱导的 ph 值变化在将培养物放回板读取器后的10-15 内逆转。 将盘子放回托盘上的湿度盒, 重新定位湿度盒盖, 然后单击 “继续”, 以进一步记录 Asl ph 值, 并监测药物/激动剂对 Asl ph 值的影响。 4. 现场 pH 校准 把盘子从盘子里拿出来。 吸出基底外侧内侧溶液。 分别在基外侧隔间和顶部表面加入750μl 和1μl 的高度缓冲标准曲线溶液。注: 高度缓冲的标准曲线解包含 (mm) 氯化钠 (86)、KCl (5)、Ccl 2 (1.2 )、MgCl 2 ( 1.2)、Nahepes 或 mes 或 tris (100 mm)。使用 MES 缓冲 pH 值低于7的溶液, 用于 pH 值7-7.5 的 N三峡 pes 和 pH 值为8的溶液的 Tris。使用 HCl 将 pH 值夹紧到所需值。 将读卡器上的 co 2 关闭或设置为 0.1%, 然后将板放回湿度盒式磁带中。 设置板读取器, 其参数与前面所述相同, 但没有步骤3.2 中所述的二氧化碳. 开始荧光读数, 每 5分钟1-1.5 小时。 5. 评价染料浓度和悬浮液体积对校准数据的影响 准备足够的 ph 敏感和不敏感的染料混合物, 在3种不同的体积中至少记录4个不同 ph 值的荧光。注: 在这里, 用26μl 的 ph 敏感点 (1 mg/mL) 和2.6μl 的 ph 不敏感 (10mg/ml) 制备了混合 1, 并将2与13μl 的 ph 敏感点 (1 mg/mL) 和1.3μl 的 ph 不敏感值 (10mgml) 混合。 将2.2Μl 或1.1μl 的混合1或混合2分别分配到96井板的12口井中, 并添加足够的校准解决方案, 以获得50、100或200μl 的最终体积并混合良好。注: 在本设置中, 将记录染料浓度为 5μg/ml (200Μl)、10μg/ml (100 或 200μl)、20μgml (50 或 100μl) 或 40μgml (50 微米) 的荧光计数。 打开板式读卡器, 将温度设置为 37°c, 然后将板插入读卡器。不要打开 CO2控制器。注: 由于这是一个简短的实验, 只需要足够的时间来平衡温度, 湿度盒式磁带是不需要的。 调整96孔板的 z 位置和增益, 并使用与半透能支承实验相同的参数。 6. 数据分析 将所有数据保存到电子表格并创建一个新文件。 在背景文件中, 为两个波长选择每个采样条件的所有平均数据, 复制并粘贴到新文件。计算每个井和每个波长的平均背景。 使用校准和动力学数据重复此操作, 并从每个数据点减去每个波长的背景。 对于每个时间点和每个样本, 计算 ph 敏感荧光和 ph 不敏感荧光之间的比率 如果所有样本都是从单个捐献者处获得的, 则计算校准曲线的每个时间点的比率平均值注: 重要的是要生成尽可能多的校准曲线作为捐献者或基外侧解决方案。事实上, 这些参数会影响背景读数或流体的吸收率, 这反过来又会影响染料浓度, 从而影响计算出的 pH 值。 对于每个时间点, 从比率生成一个标准曲线, 绘制 x 轴上的已知 pH 值和 y 轴上的比率。 确定比率稳定的时间点, 拟合线性回归线, 并获取该线的方程。 根据动力学数据, 计算每个时间点的 pH 值, 并在 y 轴上绘制 pH 值和 x 轴上的时间注: 在添加任何激动剂或任何其他干预措施之前, 可以通过在稳定测量 pH 值的基础值上平均数据点来计算。激动剂的作用可以通过计算治疗前后 (一定时间) 的 ph 值差异或在干预后直接将非线性曲线拟合到数据点来表征。这将提供有关 t 半值和最大值的其他信息。最后, 也可以从干预后安装到第一点的直线坡度中获得酸化或碱化率。