线虫生殖道内精子引导和运动的测定

注: 本协议中的所有步骤均在室温 (~ 20-22°c) 或恒温孵化器中执行, 设定为16°c 或20°c。男性和雌雄同体线虫生长使用标准的培养条件和 na22 或 op50大肠杆菌作为食物来源21,22。在下面的过程中使用了野生 N2 雌雄同体和雾 2(q71)雄性。 1. 第1天: 选择 L4 级雌雄同体进行治疗 为了获得一致的结果, 所有雌雄同体都应作为积极繁殖的成虫进行同步。将20-30 级雌雄同体采摘到6厘米种子线虫生长培养基 (NGM) 板上。在20°c 下培养雌雄同体28-30小时。请注意:只有12-15 个雌雄同体将用于交配。剩下的雌雄同体是多余的。 2. 第1天: 用荧光线粒体染料染色的男性 在未播种的 NGM 板的中心放置一个大肠杆菌 (食物点) 的点, 使男性染色板。要制作食物点, 请使用玻璃搅拌棒的末端, 将大肠杆菌从种子板的细菌草坪上刮掉, 并将其沉积在未播种的板上。圆点的直径应为 ~ 5-7 毫米。 在 DMSO 中混合 2Μl 1 Mm 线粒体染料 (见材料表) 和 10Μl mM 缓冲液 (3 克 kh 2 po4, 6g Na 2 hpo 4, 5 克氯化钠, 1 mM 1 mM 4, h2 o 至 1 l 后添加 mgso4 高压灭菌)。将所有的丝裂染料溶液输送到男性染色板上的食物点上。让盘子在黑暗中干燥 (~ 30分钟)。请注意:三丝染料对光敏感。保护所有含有丝染的溶液、板材和蠕虫不受光线的影响。将 1 mM 库存存放在-20°c。 选择 ~ 100 1-3天的成年男性 23 到丝染染色食物点上的男性染色盘。用铝箔包裹板材, 在16°c 下孵育过夜。交配时, 每12-15 个雌雄同体使用 ~ 50-60 个雄性。如果需要超过100名男性, 制作更多的染色板, 以防止男性过度拥挤。请注意:男性也可以通过在 M9 缓冲液中的10Μm 丝染溶液中孵育3小时的手表玻璃来染色。将蠕虫覆盖, 以防止蒸发和暴露。3小时后, 使用巴斯德移液将雄性转移到10厘米的种子 NGM 板上。转移尽可能少的丝裂染料溶液。将板材包裹在铝箔中, 在16°c 中孵育一夜。 3. 第2天: 约会 从第一天开始, 把被污染的雄性捡到一个新的, 种子 NGM 盘子上。把盘子放在黑暗中, 直到交配。这一步骤可确保去除男性周围多余的有丝分裂染料染色细菌。在交配板上携带过多的有丝分裂染料染色细菌可以染色雌雄同体组织。 通过将厚度的大肠杆菌混合物的 2Μl滴入未播种的 ngm 板, 制作配合板。让厚实的细菌干燥, 使交配点。雄性和雌雄同体将被转移到这个点交配。要制作厚实的大肠杆菌, 将隔夜大肠杆菌的3毫升旋转, 并在 mL 的1毫升中重新悬浮细菌颗粒。这种混合物可在4°C 下储存, 再利用长达6个月。请注意:大肠杆菌溶液的厚度可以调整。如果溶液太薄, 雄性可能会从交配点上爬出来, 而不是聚集在上面交配。用大肠杆菌溶质制成的太厚的交配点可能会降低交配效率。 当步骤3.2 中的配合板干燥时, 将300Μl 的 1% (w/v) tricaine (tri)、300μl 的 0.1% (w/v) Tetrbisole (Tet) 和900μl M9 混合在一起。请注意:将三卡因和 0.1% (w v) 作为引极剂储存在-20°c。避免反复冻融。 将 Tet/Tri 溶液的600μl 转移到手表玻璃上。 将第一天采摘的12-15 个雌雄同体转移到手表玻璃中的泰提-三溶液中。孵化 30分钟, 固定雌雄同体。保持手表玻璃覆盖, 以防止泰图三溶液蒸发。请注意:重要的是, 在图像采集过程中, 两性的麻醉时间至少为 30分钟, 减少了产生运动蠕虫的时间, 这与成像有一定的作用。 雌雄同体在孵化时, 从步骤3.1 中选择50-60 个染色雄性, 进入交配点 (步骤 3.2)。将盘子存放在黑暗中, 直到第3.8 步。 在 Tet/tri 溶液中孵育30分钟后, 使用玻璃巴斯德移液器将固定化的雌雄同体从手表玻璃转移到未播种的 NGM 板上。去除尽可能多的液体, 让多余的液体干燥。请注意:不要让雌雄同体过度干燥。一旦所有可见的液体都蒸发了, 就开始下一步。 将麻醉后的雌雄同体从未播种的 NGM 板转移到与染色雄性的交配点上。在黑暗中孵化 30分钟, 让雄性与雌雄同体交配。 交配30分钟后, 立即将雌雄同体安装以进行延时成像, 或将雌雄同体转移到一个新的种子 NGM 板上, 以休息 1小时, 然后再进行成像。请注意:利用雌雄同体子宫的延时视频来量化精子速度和反转频率。仍然图像的子宫拍摄后1小时交配被用来量化精子的分布, 或 spem 引导。 4. 第2天: 安装用于可视化的蠕虫 在h2o中创建具有2% 琼脂糖的安装垫注: 2% 琼脂糖可以散装制造, 并在玻璃试管中, 并在4°c 下储存。在需要时, 每个都可以在每次使用前进行微波微波, 并储存在热块中, 以防止其凝固。 要制作安装垫, 请将三个玻璃显微镜幻灯片并排对齐, 并可触摸长边。将两块遮罩胶带放在两个外部幻灯片上。这些带有胶带的外玻璃幻灯片将作为支撑, 因此产生的琼脂糖垫的厚度将是 “两个胶带深”。 将融化的2% 琼脂糖 ~ 75μl 放置在中心滑梯上 (这是没有胶带的幻灯片)。立即将一个新的玻璃显微镜幻灯片放在琼脂糖的顶部。这张顶部玻璃幻灯片应垂直于其他幻灯片, 每一端停留在两个支撑幻灯片的磁带上。 让琼脂糖变硬 (约 30秒)。小心地从琼脂糖垫上滑动, 取出顶部玻璃滑梯。 将 Tet/tri 溶液的10-15μl 放置在2% 琼脂糖垫上。将交配的雌雄同体转移到垫子上。注意转移尽可能少的细菌。 在琼脂糖垫上的蠕虫上放置一个盖板。 5. 第2天: 图像采集设置 请注意:任何具有弹性荧光、10倍和60x 目标的直立错误镜, 以及数码相机都可以用来获取精子分布的图像。评估精子速度、定向速度和反转频率所需的软件能够获取延时图像。 匹配后1小时的图像采集 将幻灯片安装到显微镜舞台上。通过眼片, 使用红色荧光滤光片 (TRITC 过滤器) 的10倍目标扫描琼脂糖垫上的蠕虫。一旦发现蠕虫, 请短暂打开荧光灯, 看看蠕虫是否交配。如果精子在子宫内可见, 切换到60x 目标。请注意:覆盖物上的60x 目标所产生的压力可能会损坏一些易碎的蠕虫, 导致肠道或性腺从动物身上挤压出来。使用10倍目标扫描成功交配可以最大限度地减少蠕虫暴露在增加的压力下。不要将交配的蠕虫暴露在长时间的荧光灯下。 利用微分干涉对比显微镜 (DIC), 定位蠕虫, 使外阴和一个精子。通过聚焦精子的中心来聚焦图像。检查 DIC 和 TRITC 通道的曝光情况。在 DIC 中, 内部蠕虫结构应该是清晰可见的。在 TRITC 中, 单个精子应该是可见的明显的点。请注意:每一张图片都应该捕捉子宫从外阴到精子。如果子宫太长, 无法容纳在一张图像上, 可以拍摄两个单独的图像。没有必要在相同的曝光水平下拍摄所有图像。然而, 重要的是, 单个精子可以在荧光图像中进行区分和量化。 获取每个子宫的 DIC 和荧光图像。 重复步骤 5.1.1-5.1.3, 直到所有交配的雌雄同体已被成像。 拍摄延时视频 扫描琼脂糖垫, 并定位子宫内含有标记精子的雌雄同体, 如步骤5.1.1 和5.1。2 配置软件以获取 DIC 和 TRITC 通道中的延时图像。一般情况下, 延时图像是以15-30 的间隔拍摄的, 每个子宫10-20。 6. 量化 定量精子在交配后1小时拍摄的子宫图像上的分布 从一端的外阴和另一端的精子, 将子宫分成三分之二。这将表示三个区域。区域 1 (Z1) 包含外阴, 3 区 (Z3) 包含精子。 手动统计子宫每三分之一内的精子数量, 并将每个区域中的精子数量报告为整个子宫中精子总数的百分比。下面提供了一个示例。注: 有时, TRITC 通道图像的信号强度需要调整, 以便图像中捕获的每个精子都可以看到和量化。 在延时图像中跟踪精子请注意:在本文中, 我们使用 nis-元素软件进行分析。在下面的部分中, 我们给出了使用此软件手动跟踪精子的说明 (步骤 6.2.1) 以及开源软件 imagej函斐济 (步骤 6.2.2)。 用 nis 元素追踪精子 打开具有要跟踪的延时序列的. nd2 文件。要开始跟踪, 请右键单击软件并选择”分析控制”, 打开 “跟踪” 面板追踪就好 在跟踪面板中, 选择 “定义新投资回报率”。通过单击要跟踪的每个精子来定义每个感兴趣的区域 (ROI)。所选精子上将出现彩色标记。选择了所有 Roi 后, 单击”完成” 。 一旦确定了 Roi, 就移动到延时系列中的下一帧。将 ROI 标记拖动到图像中精子的新位置。继续这样做, 直到精子不能再被跟踪。将出现虚线, 将通过延时图像的所有帧连接 roi 标记放置的每个位置。请注意:即使在野生动物中, 也应将第2区中的精子跟踪为第1区和第3区的精子, 它们往往以圆形的方式移动。 通过单击 “跟踪” 面板中的”导出” , 将所有可量化的数据 (例如路径长度、时间、xy 位置等) 从跟踪的精子导出到 excel 文档。 与斐济一起追踪精子 将延时系列中的 TRITC 通道图像转换为. tif 文件。将一个系列中的所有文件保存到一个文件夹中。 使用 “生物格式” 导入函数将图像导入到斐济。将图像从一个延时序列导入为一个超堆栈。 在斐济通过插件打开 TrackMate 24 追踪我们使用 Track配合特进行手动跟踪。将打开一个对角线框。 在斐济工具栏中选择 “跟踪方法” 工具。双击将被跟踪的精子。将出现一个带有虚线的绿色圆圈。这个圆圈可以通过在圆圈内点击并拖动到所需的位置来重新定位。通过同时按alt键和滚动鼠标, 可以更改此圆的大小。 设置了跟踪器的大小和位置后, 再次单击圆圈。虚线将变成一条实心绿线。同时命中shift键和l键打开跟踪模式。这将在斐济工具栏中显示。 移动到延时系列中的下一帧。要在新框架中设置跟踪精子的新位置, 请将鼠标悬停在新点上, 然后按a键。跟踪器现在将出现在新位置, 并将显示一条连接跟踪器已放置在以前帧中的位置的行。 完成跟踪后, 单击 “跟踪方法” 对话框中的”分析”以生成所需的数据。 若要计算速度, 请将精子的总路径长度除以经过的时间。 要计算矢量速度, 从指向精子的外阴开始, 通过子宫画一条线。测量精子从痕迹开始到结束沿着这条线迁移的距离。把这个距离除以经过的时间。负值表示精子已经从精子中迁移出去。 要记录反转频率, 请计算精子轨迹在三个连续的延时帧内产生小于90°的角度的次数。