Elektrofysiologiska inspelningar av encellig Jon strömmar under väldefinierad skjuvning stress
Summary
Målet med detta protokoll är att beskriva en modifierad parallell platta flödes kammare för användning vid utredning av realtids aktivering av mechanosensitive jonkanaler genom skjuvning stress.
Abstract
Fluid skjuvning stress är väl känt att spela en viktig roll i endotelfunktion. I de flesta vaskulära sängar, förhöjda skjuvning stress från akuta ökningar i blodflödet utlöser en signalering kaskad resulterar i vasodilatation därigenom lindra mekanisk stress på kärlväggen. Mönstret av skjuvning stress är också väl känd för att vara en kritisk faktor i utvecklingen av åderförkalkning med laminär skjuvning stress är atheroprotective och störd skjuvning stress är Pro-aterogena. Medan vi har en detaljerad förståelse av de olika mellanliggande cell signalering vägar, de receptorer som först översätta mekanisk stimulans till kemiska medlare är inte helt klarlagda. Mechanosensitive jonkanaler är avgörande för svaret på skjuvning och reglera skjuvning-inducerad cellsignalering därmed kontrollera produktionen av vasoaktiva medlare. Dessa kanaler är bland de tidigaste aktiverade signalering komponenter till skjuvning och har kopplats till skjuvning-inducerad vasodilatation genom att främja kväveoxid produktion (t. ex., invärl rättelse K+ [Kir] och övergående receptor potential [TRP] kanaler) och endotel hyperpolariserande faktor (t. ex., Kir och kalcium-aktiverade K+ [KCA] kanaler) och skjuvning-inducerad vasokonstriktion genom en obestämd mekanism som involverar piezo kanaler. Att förstå den biofysiska mekanismen genom vilken dessa kanaler aktiveras av skjuvkrafter (dvs. direkt eller genom en primär Mechano-receptor) kan ge potentiella nya mål för att lösa patofysiologin i samband med endoteldysfunktion och aterogenes. Det är fortfarande en stor utmaning att spela in flödesinducerad aktivering av jonkanaler i realtid med hjälp av elektrofysiologi. De standardmetoder för att exponera celler till väldefinierad skjuvning stress, såsom konen och plattan skjuvreometer och slutna parallella plattan flöde kammare tillåter inte realtid studie av Jon kanal aktivering. Målet med detta protokoll är att beskriva en modifierad parallell plattans flödes kammare som möjliggör Elektrofysiologisk inspelning i realtid av mekankänsliga jonkanaler under väldefinierad skjuvbelastning.
Introduction
Hemodynamiska krafter som genereras av blodflödet är väl kända för att spela stora roller i endotelial och vaskulär funktion1,2. Det är också välkänt att flera typer av jonkanaler akut reagerar på förändringar i skjuvning stress3,4,5 som leder till hypotesen att jonkanaler kan vara primära skjuvning stress sensorer. Mer nyligen visade vi och andra att mechanosensitive jonkanaler spelar kritiska roller i flera skjuvning-stresskänsliga vaskulära funktioner, inklusive vasoaktiva svar på skjuvning stress6,7,8 , och utvecklingsmässig angiogenes9. Mekanismerna för skjuvning-stress känslighet jonkanaler, dock, är nästan helt okända. Detta kunskapsgap kommer sannolikt att bero på den tekniska svårigheten att utföra elektrofysiologiska inspelningar under väldefinierad skjuvning stress. I den här artikeln, därför ger vi ett steg för steg detaljerat protokoll rutinmässigt utförs i vårt labb för att uppnå detta mål6,7,10,11.
Det övergripande målet med denna metod är att möjliggöra realtids undersökning av Jon kanals mechanoactivation under väldefinierad skjuvning stress i det fysiologiska området. Detta åstadkoms genom att en standard flödes kammare för parallell plattan ändras så att en Elektrofysiologisk pipett kan sänkas ner i kammaren och få tillgång till celler som odlas på bottenplattan under realtids exponeringen för flöde, vilket ger en unik metod för att uppnå detta mål6,7,11. Standard flödes kammare med parallella plattor, beskrivna i tidigare publikationer, kan däremot användas för analys av realtidsbilder av celler som utsätts för skjuvkrafter12 eller andra icke-invasiva metoder13,14 men inte för Elektrofysiologi. Likaså konen och plattan apparat, en annan kraftfull metod för att exponera celler för skjuvning stress15,16 är inte heller lämplig för elektrofysiologiska inspelningar. Sålunda, dessa flödes anordningar tillåter inte utredning av skjuvning stress känslighet jonkanaler. Svårigheten att utföra elektrofysiologiska inspelningar under Flow är den främsta orsaken till bristen på information om de mekanismer som ansvarar för dessa avgörande effekter.
När det gäller de alternativa metoder för att uppnå samma mål, det finns ingen som är så noggrann eller kontrollerad. Vissa tidigare studier försökte registrera Jon kanalens aktivitet underflöde genom att exponera celler för en ström av vätska som kommer från en annan pipett som förs till närheten av en cell från ovan17,18. Detta är mycket icke-fysiologisk, eftersom de mekaniska krafterna som genereras under dessa förhållanden har lite gemensamt med de fysiologiska profilerna för skjuvning stress i blodkärlen. Liknande farhågor gäller försök att simulera fysiologiska skjuvning stress genom perfusion av öppna kammare. Som diskuterats i detalj i vår tidigare studie10, en öppen vätske-luftgränssnitt skapar flera störningar och återcirkulation, som är icke-fysiologiska. För att ta itu med alla dessa frågor har vi utformat en modifierad parallell platta (MPP) Flow Chamber, även kallad “minimalinvasiv Flow Device” i våra tidigare studier6,7,10,11, Made från akryl och används flitigt i vårt labb. Trots det faktum att den ursprungliga beskrivningen av konstruktionen har publicerats för nästan 20 år sedan och är den enda flödes anordning som gör det möjligt att utföra elektrofysiologiska inspelningar under väldefinierad skjuvning stress, har denna metod inte varit antagen av andra laboratorier och det finns bara mycket få studier som försöker spela in strömmar underflöde. Vi tror därför att ge en detaljerad beskrivning för att använda MPP Flow kammaren kommer att vara till stor hjälp för forskare som är intresserade av mechanosensitive jonkanaler och vaskulär biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det vaskulära systemet utsätts ständigt för aktiva hemodynamiska krafter, som aktiverar mechanosensitive jonkanalerna3,22 , men de fysiologiska rollerna hos dessa kanaler i skjuvning stressinducerad meanotransduktion är endast börjar dyka upp4,6,8. Mekanismerna som ansvarar för mechanosensitiviteten hos skjuvspännings aktiverade kanaler är fortfarande okända. D…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av National Heart, lung, och Blood Institute (R01 HL073965, IL) och (T32 HL007829-24, ISF). Författarna skulle också vilja erkänna den vetenskapliga maskin butiken vid University of Illinois i Chicago för att skapa våra senaste MPP Flow Chambers.
Materials
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
Riferimenti
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?. Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of ‘Shear Rings’: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
