Elektrophysiologische Aufnahmen von einzelzelligen Ionenströmen unter genau definiertem Scherspannung
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine modifizierte parallele Plattendurchflusskammer für die Untersuchung der Echtzeitaktivierung von mechanosensitiven Ionenkanälen durch Scherspannung zu beschreiben.
Abstract
Flüssigkeitsscherspannung ist bekannt, eine wichtige Rolle in der endothelialen Funktion zu spielen. In den meisten Gefäßbetten löst ein erhöhter Scherstress durch akute Nukzesserhöhungen eine Signalkaskade aus, was zu vasodilatation führt und dadurch die mechanische Belastung der Gefäßwand lindert. Das Muster der Scherspannung ist auch bekannt als ein kritischer Faktor bei der Entwicklung von Arteriosklerose mit laminaren Scherstress atheroprotective und gestörtscher Stress pro-atherogen. Während wir ein detailliertes Verständnis der verschiedenen Zwischenzellsignalwege haben, werden die Rezeptoren, die zuerst den mechanischen Stimulus in chemische Mediatoren übersetzen, nicht vollständig verstanden. Mechanosensitive Ionenkanäle sind entscheidend für die Reaktion auf die Scherung und regulieren die scherinduzierte Zellsignalisierung und steuern so die Produktion von vasoaktiven Mediatoren. Diese Kanäle gehören zu den frühesten aktivierten Signalkomponenten zum Scheren und wurden durch Förderung der Stickstoffmonoxidproduktion mit der scherinduzierten Vasodilatation in Verbindung gebracht (z.B. nach innen korrigierende K+ [Kir] und transientes Rezeptorpotential [TRP] Kanäle) und Endothel-Hyperpolarisierungsfaktor (z. B. Kir- und Calcium-aktivierte K+ [KCa]-Kanäle) und scherinduzierte Vasokonstriktion durch einen unbestimmten Mechanismus, der Piezokanäle umfasst. Das Verständnis des biophysikalischen Mechanismus, durch den diese Kanäle durch Scherkräfte (d. h. direkt oder durch einen primären Mechano-Rezeptor) aktiviert werden, könnte potenzielle neue Ziele zur Lösung der pathophysiologie im Zusammenhang mit endotheliaaler Dysfunktion bieten. und Atherogenese. Es ist immer noch eine große Herausforderung, die strömungsinduzierte Aktivierung von Ionenkanälen in Echtzeit mittels Elektrophysiologie aufzuzeichnen. Die Standardmethoden zur Belichtung von Zellen gegenüber klar definierter Scherspannung, wie dem Kegel- und Plattenrheometer und der geschlossenen parallelen Plattendurchflusskammer, erlauben keine Echtzeituntersuchung der Ionenkanalaktivierung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine modifizierte parallele Plattendurchflusskammer zu beschreiben, die eine elektrophysiologische Echtzeitaufzeichnung mechanosensitiver Ionenkanäle unter genau definierter Scherspannung ermöglicht.
Introduction
Hämodynamische Kräfte, die durch den Blutfluss erzeugt werden, sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle in der endothelialen und vaskulären Funktion1,2zu spielen. Es ist auch bekannt, dass mehrere Arten von Ionenkanälen akut auf Veränderungen der Scherspannung3,4,5 reagieren, was zu der Hypothese führt, dass Ionenkanäle primäre Scherspannungssensoren sein können. In jüngerer Zeit haben wir und andere gezeigt, dass mechanosensitive Ionenkanäle in mehreren scher-stressempfindlichen Gefäßfunktionen eine entscheidende Rolle spielen, einschließlich der vasoaktiven Reaktion auf Scherstress6,7,8 und Entwicklungsangiogenese9. Die Mechanismen der Scher-Stress-Empfindlichkeit von Ionenkanälen sind jedoch fast völlig unbekannt. Diese Wissenslücke ist wahrscheinlich auf die technische Schwierigkeit zurückzuführen, elektrophysiologische Aufnahmen unter genau definierter Scherspannung durchzuführen. In diesem Artikel bieten wir daher ein Schritt für Schritt detailliertes Protokoll routinemäßig in unserem Labor durchgeführt, um dieses Ziel zu erreichen6,7,10,11.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Echtzeit-Untersuchung der Ionenkanal-Mechanoaktivierung unter genau definiertem Scherstress im physiologischen Bereich zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem eine Standard-Parallelplattendurchflusskammer so geändert wird, dass eine elektrophysiologische Pipette in die Kammer abgesenkt und Zugangszellen, die während der Echtzeit-Exposition zum Durchfluss auf der Bodenplatte angebaut werden, abgesenkt werden können, was einen einzigartigen Ansatz bietet, dies zu erreichen. Tor6,7,11. Im Gegensatz dazu können Standard-Parallelplattendurchflusskammern, die in früheren Veröffentlichungen beschrieben wurden, für die Echtzeit-Bildgebungsanalyse von Zellen verwendet werden, die Scherkräften12 oder anderen nicht-invasiven Ansätzen13,14 Elektrophysiologie. In ähnlicher Weise ist der Kegel- und Plattenapparat, ein weiterer starker Ansatz, um Zellen Scherspannung15,16 auszusetzen, auch nicht für elektrophysiologische Aufnahmen geeignet. Somit erlauben diese Durchflussgeräte keine Untersuchung der Scherspannungsempfindlichkeit von Ionenkanälen. Die Schwierigkeit bei der Durchführung elektrophysiologischer Aufnahmen unter Fließen ist der Hauptgrund für die Mangel an Informationen über die Mechanismen, die für diese entscheidenden Effekte verantwortlich sind.
In Bezug auf die alternativen Ansätze, um das gleiche Ziel zu erreichen, gibt es keine, die so genau oder kontrolliert sind. Einige frühere Studien versuchten, die Ionenkanalaktivität unter dem Durchfluss aufzuzeichnen, indem zellen einem Flüssigkeitsstrom aus einer anderen Pipette aus einer anderen Pipette aus der Nähe einer Zelle von oben17,18aussetzten. Dies ist sehr nicht-physiologisch, da die unter diesen Bedingungen erzeugten mechanischen Kräfte wenig mit den physiologischen Profilen von Scherstress in den Blutgefäßen gemein haben. Ähnliche Bedenken gelten für die Versuche, physiologische Scherspannung durch Durchblutung offener Kammern zu simulieren. Wie in unserer früheren Studie10ausführlich erläutert, erzeugt eine offene Flüssigkeits-Luft-Schnittstelle mehrere Störungen und Dierezirkulation, die nicht-physiologisch sind. Um all diese Bedenken auszuräumen, haben wir in unseren früheren Studien6,7,10,11, eine modifizierte Parallelplatte (MPP) Strömungskammer entworfen, die auch als “minimal-invasives Durchflussgerät” bezeichnet wird. aus Acryl und ausgiebig in unserem Labor verwendet. Trotz der Tatsache, dass die ursprüngliche Beschreibung des Designs vor fast 20 Jahren veröffentlicht wurde und das einzige Strömungsgerät ist, das die Durchführung elektrophysiologischer Aufnahmen unter genau definierter Scherspannung ermöglicht, wurde diese Methode nicht von anderen Labors angenommen und es gibt nur sehr wenige Studien, die versuchen, Ströme unter Fluss zu erfassen. Wir glauben daher, dass die Bereitstellung einer detaillierten Beschreibung für die Verwendung der MPP-Flusskammer eine große Hilfe für Forschungen sein wird, die sich für mechanosensitive Ionenkanäle und Gefäßbiologie interessieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Gefäßsystem ist ständig aktiven hämodynamischen Kräften ausgesetzt, die mechanosensitive Ionenkanäle3,22 aktivieren, aber die physiologischen Rollen dieser Kanäle in der Scherstress-induzierten Mechanotransduktion sind nur 4,6,8. Die Mechanismen, die für die Mechanosensitivität von scherenspannungsaktivierten Kanälen verantwortlich sind, bleiben unbekannt. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL073965, IL) und (T32 HL007829-24, ISF) finanziert. Die Autoren möchten auch den Scientific Machine Shop an der University of Illinois in Chicago für die Generierung unserer neuesten MPP-Flusskammern würdigen.
Materials
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
Riferimenti
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