Her presenterer vi en protokoll av voksen mus Terminal falanks amputasjon å undersøke pattedyr blastema dannelse og Intramembranous forbening, analysert av fluorescerende immunhistokjemi og sekvensiell in-vivo microcomputed tomografi.
Her presenterer vi en protokoll av voksen mus falanks Terminal (P3) amputasjon, en Prosedyremessig enkel og reproduserbar pattedyr modell av epimorphic gjenfødelse, som innebærer blastema dannelse og Intramembranous forbening analysert av fluorescens immunhistokjemi og sekvensiell in-vivo microcomputed tomografi (Benvolum). Regenerering av pattedyr er begrenset til amputasjoner transecting den delen av Terminal falanks (P3). sifre amputert på mer proksimale nivåer mislykkes i å regenerere og gjennomgå antifibrotiske healing og arrdannelse. Den regenerering responsen er formidlet av dannelsen av en proliferativ blastema, etterfulgt av bein regenerering via Intramembranous forbening å gjenopprette amputert skjelett lengde. P3 amputasjon er en prekliniske modell for å undersøke epimorphic regenerering i pattedyr, og er et kraftig verktøy for utforming av terapeutiske strategier for å erstatte antifibrotiske helbredelse med en vellykket regenererende respons. Vår protokoll bruker fluorescens immunhistokjemi til 1) identifisere tidlig-og-sent blastema celle populasjoner, 2) studie revaskularisering i sammenheng med regenerering, og 3) undersøke Intramembranous forbening uten behov for komplekse bein og stabiliserings enheter. Vi demonstrerer også bruken av sekvensiell in vivo Benvolum for å lage bilder med høy oppløsning for å undersøke morfologiske endringer etter amputasjon, i tillegg til å kvantifisere volum-og lengde endringer i samme siffer i løpet av regenerering. Vi tror denne protokollen tilbyr enorm nytte å undersøke både epimorphic og vev regenererende svar i pattedyr.
Pattedyr, inkludert mennesker og mus, har kapasitet til å regenerere tuppen av sine sifre etter en slik amputasjon av Terminal falanks (P3)1,2,3. I mus, den regenerering responsen er amputasjon-nivå-avhengig; stadig proksimale siffer amputasjoner vise en gradvis svekket regenererende respons til fullstendig regenererende svikt på amputasjoner transecting og proksimale til P3 Nail Matrix4,5,6 , 7 andre er , 8. P3 regenerering er formidlet av dannelsen av en blastema, definert som en befolkning på voksende celler som gjennomgår morphogenesis å regenerere amputert strukturer9. Dannelsen av en blastema å regenerere strukturene tapt ved amputasjon, en prosess betegnes epimorphic gjenfødelse, skiller multi-vev-nivå P3 regenerering respons fra tradisjonelle vev reparasjon etter skade6, 10. P3 regenerering er en reproduserbar og Prosedyremessig enkel modell for å undersøke komplekse regenererende prosesser inkludert såret healing11,12, Bone histolysis11,12, revaskularisering13, perifere nerve regenerering14, og blastemal konvertering til bein via Intramembranous forbening15.
Tidligere studier bruker immunhistokjemi har vist at blastema er heterogen, Avascular, hypoxic, og svært proliferativ11,13,15,16. Etter den begynnende P3 amputasjon, er den tidlige blastema i utgangspunktet knyttet til P3-periosteum og endosteum og kjennetegnes av robust spredning og gryende Osteogenesis ved siden av bein overflaten15. Etter bein degradering og sår lukking, dannes den heterogene blastema ved sammenslåing av periostal og endosteal celler, etterfulgt av differensiering av blastemal komponenter, inkludert bein via Intramembranous forbening 15av dem.
Bone reparasjon som svar på skade vanligvis oppstår ved endokondral forbening, dvs via en innledende cartilaginous Callus som danner en mal for påfølgende bein formasjon17,18. Lange ben Intramembranous forbening, dvs., beindannelse uten cartilaginous mellomliggende, er vanligvis indusert ved hjelp av komplekse distraksjon enheter eller kirurgisk fiksering19,20. Den sifrede regenerering responsen er en pre-klinisk modell som gir fordeler fremfor konvensjonelle Intramembranous forbening modeller: 1) det krever ikke ekstern eller intern fiksering etter skade for å stimulere Intramembranous forbening, 2) det er utført benytter 4 sifre fra hver dyr, således maksimere eksemplar stund minimere dyr bruk, og 3) sammenhengende inne vivo microcomputed tomografi (Benvolum) analyse kan utført med lette og fart.
I denne studien viser vi standardisert P3 amputasjon flyet for å oppnå en reproduserbar og robust regenerering respons. I tillegg viser vi en optimalisert fluorescens immunhistokjemi protokoll ved hjelp av para fin seksjoner for å visualisere blastema formasjon, revaskularisering i sammenheng med regenerering, og blastemal konvertering til bein via Intramembranous forbening. Vi demonstrerer også bruken av sekvensielle in-vivo Benvolum for å identifisere endringer i bein morfologi, volum og lengde i samme siffer i løpet av regenerering. Målet med denne protokollen er å undersøke pattedyr blastema formasjon etter amputasjon og å demonstrere 2 teknikker, fluorescens immunhistokjemi og sekvensiell in vivo Benvolum, for studiet av Intramembranous bein gjenfødelse.
Denne protokollen beskriver en standardisert prosedyre av voksen mus som er i ferd P3 amputasjon, fluorescerende immunhistokjemiske farging for å visualisere og undersøke blastema formasjon og Intramembranous forbening, og sekvensiell in-vivo Benvolum skanning til identifisere bein morfologiske, volum og lengde endringer etter amputasjon. P3 amputasjon er en unik, Prosedyremessig enkel, og reproduserbar modell for å analysere en Pro-regenererende sår miljø som utløser blastema formasjon. Videre, det P3 tall modell …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer av Muneoka Lab og Texas Institute for genomisk Medicine (TIGM). Dette arbeidet ble støttet av Texas A & M University.
Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
vivaCT 40 | SCANCO Medical |