온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가
Summary
여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.
Abstract
수많은 세포내 단백질은 세포내 및 세포외 상황에 따라 물리적으로 상호 작용합니다. 실제로, 세포 기능은 주로 세포 내 단백질-단백질 상호 작용에 따라 달라 집니다. 따라서, 이러한 상호 작용에 관한 연구는 생리 적 프로세스의 이해를 촉진 하는 데 필수적이다. 질량 분석법 (MS) 분석에 선행된 관련 단백질의 공동 침전은, 새로운 단백질 상호 작용의 확인을 가능하게 합니다. 이 연구에서는, 우리는 단백질-단백질 상호 작용의 분석을 위한 온 막 소화와 결합된 면역 침전 액체 크로마토그래피 (LC)-MS/MS 분석의 새로운 기술의 세부사항을 제공했습니다. 이 기술은 원유 면역 침전제에 적합하며 단백질 분석의 처리량을 향상시킬 수 있습니다. 태그가 지정된 재조합 단백질은 특이적 항체를 사용하여 침전되었고; 다음으로, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 조각에 블린된 면역침전제는 환원 알킬화를 행하였다. 트립시니화 후, 소화된 단백질 잔기를 LC-MS/MS를 사용하여 분석하였고, 이 기술을 사용하여, 우리는 여러 후보 관련 단백질을 식별할 수 있었다. 따라서, 이 방법은 새로운 단백질-단백질 상호작용의 특성화에 편리하고 유용하다.
Introduction
단백질은 살아있는 유기체에서 구성적인 역할을 하지만, 세포 내 환경에서 지속적으로 합성, 처리 및 저하됩니다. 더욱이, 세포내 단백질은 자주 물리적으로 그리고 생화학적으로 상호 작용하며, 이는 하나 또는 둘 다의 기능에 영향을 미치는 1,2,3. 예를 들어, 진핵 번역 개시 인자 4A3(eIF4A3)과 스플리케오솜 관련 단백질 상동체 CWC22의 직접 결합은 엑소온 접합 복합체4의조립에 필요하다. 이와 일치하여, CWC22에 대한 친화력이 결여된 eIF4A3 돌연변이체는 엑온 접합복합체 구동 mRNA 접합을 용이하게 하지 못한다 4. 따라서, 단백질 상호 작용의 연구는 세포 기능뿐만 아니라 생리학적 조절의 정확한 이해를 위해 중요합니다.
질량 분석법 (MS)에 있는 최근 어드밴스는 단백질 단백질 상호 작용의 포괄적인 분석에 적용되었습니다. 예를 들어, 내인성 단백질의 공동 침전 또는 외인성 으로 그들의 관련 단백질과 함께 태그가 부착된 단백질을 도입하고, MS 분석에 이어, 새로운 단백질 상호작용의 식별을 가능하게한다5. 그러나, MS/MS 분석의 한 주요 병목 현상은 단백질 샘플의 tryptic 소화에서 가난한 복구. 세포 용해제에 대한 단백질 분석을 수행하기 위해, 인젤 및 온 막 소화 기술은 일반적으로 MS / MS 샘플을 준비하기 위해 사용됩니다. 우리는 이전에 온 막 소화 기술 6와 인 젤 소화절차를 비교하고, 후자는 더 나은 서열 범위와 연관되었다는 것을 보여주었습니다. 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인은 유기 용제7,8의고농도에 기계적으로 견고하고 내성이 있기 때문에 이러한 목적에 적합할 수 있으며, 고정화의 효소 소화를 허용한다. 80 % 아세토니트릴 9의존재에 단백질 . 더욱이, 막에 고정화는 표적 단백질에 있는 형태 변경을 유도할 수 있고, 시도소화 효율에 있는 개선으로 이끌어 내는10. 따라서, 이 문서에서는, 우리는 온 막 소화 기술을 사용하여 단백질 상호 작용의 면역 침전-LC/MS/MS 분석의 사용을 기술했습니다. 이 간단한 방법은 비 전문 실험실에서도 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하게 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 이전에 온 막 소화 기술에 선행된 LC-MS/MS를 사용하여 산화된 저밀도 지단백에 있는 아폴리포단백질 B-100의 산화수정의 분석을 기술했습니다 6. 본 연구에서, 우리는 면역 침전과 이 기술을 결합하고 몇몇 calpain-6 관련 단백질을 확인했습니다. 이러한 신규 한 기술은 후보 관련 단백질에 대한 편리한 스크리닝 방법을 나타낸다. Calpain-6는 단백질-단백질 상호작용<sup class="xref"…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구는 일본과학교부교부제 17K09869(오전), 일본과학교부교15K09418(TM)의 연구보조금인 가네하라 이치로의학재단의 연구보조금에 의해 부분적으로 지원되었다. 스즈켄 기념재단(TM)의 연구보조금.
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
Riferimenti
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