Analyse expérimentale de l’Engloutement des thymocytes apoptotiques par les macrophages
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour préparer les thymocytes apoptotiques et les macrophages péritonéaux et analyser l’efficacité de l’effocytose et le blocage spécifique par inhibiteur de l’engloutement des thymocytes apoptotiques. Ce protocole a une application large dans le dégagement de cellules-médiation d’autres particules y compris les billes artificielles et les bactéries.
Abstract
L’apoptose cellulaire est un processus naturel et joue un rôle crucial dans le développement embryonnaire, la régulation homéostatique, l’induction de la tolérance immunitaire et la résolution de l’inflammation. L’accumulation de débris apoptotiques dans le corps peut déclencher des réactions inflammatoires chroniques qui conduisent à des maladies auto-immunes systémiques au fil du temps. Une altération de la clairance des cellules apoptotiques a été impliquée dans une variété de maladies auto-immunes. La clairance apoptotique est un processus complexe rarement détecté dans des conditions physiologiques. Il implique des récepteurs de surface abondants et des molécules de signalisation. L’étude du processus de clairance des cellules apoptotiques fournit des mécanismes moléculaires perspicaces et des réponses biologiques ultérieures, ce qui peut conduire au développement de nouvelles thérapies. Ici, nous décrivons les protocoles pour l’induction des thymocytes apoptotiques, la préparation des macrophages péritonéaux, et l’analyse de la clairance des cellules apoptotiques par cytométrie en flux et microscopie. Toutes les cellules seront soumises à une apoptose à un certain stade, et de nombreuses cellules résidentielles et circulantes peuvent absorber les débris apoptotiques. Par conséquent, le protocole décrit ici peut être utilisé dans de nombreuses applications pour caractériser la liaison de cellules apoptotiques et l’ingestion par de nombreux autres types de cellules.
Introduction
Notre corps génère 1-10 milliards de cellules apoptotiques sur une base quotidienne. Un tel grand nombre de cellules apoptotiques doit être effacé de manière à ce que les réponses immunitaires demeurent quiescentes. Pour assurer le dégagement des cellules apoptotiques en temps opportun, de nombreux types de cellules résidentes de tissu et de cellules circulantes développent des mécanismes pour engloutir les cellules apoptotiques1. La régulation dysfonctionnelle de l’apoptose a été impliquée dans l’apparition et la progression de diverses maladies inflammatoires et de l’auto-immunité2. L’apoptose joue également un rôle crucial dans la pathogenèse du développement du cancer et sa résistance subséquente aux traitements conventionnels3,4. L’élimination des cellules apoptotiques favorise généralement une réponse anti-inflammatoire, qui peut être liée à la tolérance immunologique5. La perturbation de la clairance des cellules apoptotiques entraîne l’auto-immunisation et contribue au développement de maladies auto-immunes systémiques chez l’homme et la souris6.
Lorsque les cellules subissent l’apoptose, elles exposent la phosphatidylsérine (PtdSer) de la foliole interne à la foliole externe de la membrane. Le PtdSer sera alors reconnu par les phagocytes par les récepteurs de surface. Plus d’une douzaine de récepteurs ont été identifiés pour reconnaître et/ou faciliter l’engloutement des cellules apoptotiques. En général, il existe au moins trois types de récepteurs de surface impliqués dans le dégagement des cellules apoptotiques: récepteurs d’attachement, reconnaître les cellules apoptotiques; les récepteurs de chatouillement, initier l’engulfment; les récepteurs de chaperonner, facilitent l’ensemble du processus7. Les tyrosine kinases du récepteur TAM (TAM RTKs) consistent en Tyro-3, AXL et Mer et sont principalement exprimées par les cellules myéloïdes du système immunitaire8. La fonction principale de TAM RTKs est de servir de récepteurs d’attachement, facilitant l’élimination phagocytaire des cellules apoptotiques et des débris. Notre groupe a étudié la clairance cellulaire apoptotique médiée par TAM dans le cadre de l’auto-immunité pendant de nombreuses années. La protéine dépendante de la vitamine K-dépendant de l’arrestation de protéine 6 (Gas6) et de protéine S (ProS) se lie à et active les récepteurs de Tam9,10. Gas6 est produit dans le coeur, les reins et les poumons. Les ProS sont principalement produits dans le foie11. TAM reconnaît des cellules apoptotiques de telle sorte que le N-terminal de Gas6/ProS se lie au PtdSer sur une cellule apoptotique et le C-terminal de Gas6/ProS se lie aux récepteurs TAM qui ancrés sur la surface des phagocytes. Avec les autres récepteurs, l’flammes des cellules apoptotiques se produit12. Bien que mer puisse se lier à la fois pour les ligands ProS et Gas6, nous avons constaté que Gas6 semble être le seul ligand pour la phagocytose de macrophages de cellules apoptotiques médiées par mer, qui peut être bloquée par l’anticorps anti-mer13. Les macrophages sont des phagocytes professionnels. L’élimination rapide des cellules apoptotiques par les macrophages est importante pour l’inhibition de l’inflammation et des réponses auto-immunes contre les antigènes intracellulaires. Le récepteur de la mer tyrosine kinase est essentiel pour l’engloutement des macrophages et une clairance efficace des cellules apoptotiques14. Dans la rate de souris, mer exprime principalement sur la zone marginale et les macrophages corporels13.
Le protocole présenté ici décrit une méthode de base pour induire l’apoptose cellulaire et de démontrer des moyens de mesurer le processus et l’efficacité de l’effocytose. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés pour étudier l’effocytose par d’autres types de cellules dans l’flammes de cellules apoptotiques d’origines différentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’apoptose est un processus de mort cellulaire hautement conservé qui implique de nombreuses cascades de signaux et induit l’expression des protéines, la sécrétion et le transport. L’apoptose est souvent associée à des changements de morphologie cellulaire17. Les cellules apoptotiques libèrent activement des cytokines et des chimiokines qui attirent les phagocytes pour migrer vers le site et initier le processus d’engloutement, une voie extrêmement complexe sous contrôle serré<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche dans le laboratoire de Shao est soutenue par le prix novateur de recherche du Collège de médecine et le prix de pilote de la faculté junior du département de médecine interne, Université de Cincinnati et Grant DK K01_095067 de NIDDK/NIH.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
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