JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

Minimal arka plan saçılma ile Macromoleküler X-ışını Kristalografi için bir hepsi bir arada örnek tutucu

Published: July 06, 2019
doi:
10.3791/59722
, ,
1Macromolecular Crystallography (HZB-MX),Helmholtz-Zentrum Berlin, 2Department Sample Environment,Helmholtz-Zentrum Berlin

Summary

Makromoleküler X-ışını Kristalografi için yeni bir örnek tutucu ile birlikte uygun bir kullanım Protokolü sunulmaktadır. Sistem, kristal büyümesi, kristal ıslanmasına ve herhangi bir kristal manipülasyon veya montaj gerek kalmadan her iki, ortam ve kriyojenik sıcaklık içinde situ dikesasyon veri toplama sağlar.

Abstract

Makromoleküler X-ışını Kristalografi (MX), Biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü üç boyutlu bilgisini elde etmek için en belirgin yöntemdir. Yöntem için bir ön koşul, yüksek derecede sipariş edilen kristalin numunesinin incelenmek üzere macromolekül ‘den yetişmek zorunda olduğu, bu da dikeslik deneyi için hazırlıklı olması gerekir. Bu hazırlık prosedürü genellikle kristal, ligand solüsyonu veya Cryo-protectant çözeltisi içinde yetiştirilen ve daha sonra deney için uygun bir Mount üzerinde kristal immobilizing, büyüyen bir çözüm, kristalin kaldırılması içerir. Bu prosedür için ciddi bir sorun makromoleküler kristallerin genellikle mekanik olarak kararsız ve oldukça kırılgan olmasıdır. Sonuç olarak, bu tür kırılgan kristallerin işlenmesi kolayca bir yapı belirlenmesi girişimi bir darboğaz haline gelebilir. Bu tür hassas kristaller için uygulanan herhangi bir mekanik kuvvet moleküllerin düzenli paketleme rahatsız edebilir ve kristallerin kırınım gücü kaybına yol açabilir. Burada, kristallerin işleme adımlarını en aza indirmek ve dolayısıyla yapı belirlenmesi deneyinin başarı oranını maksimize etmek için geliştirilen, tüm-bir-bir örnek tutucu, bir roman sunuyoruz. Örnek tutucu, yaygın olarak kullanılan mikroskop kapak fişi değiştirerek kristal damla kurulumunu destekler. Ayrıca, kristalizasyon boşluğu herhangi bir açılış ve kristal elleçleme olmadan ligand iliklerine, Cryo-koruma ve karmaşık oluşumu gibi yerinde kristal manipülasyon sağlar. Son olarak, örnek tutucu her iki, ortam ve kriyojenik sıcaklık içinde situ X-ışını dikeslik veri toplanması sağlamak için tasarlanmıştır. Bu örnek tutucuyu kullanarak, kristalleşme işleminden kristal veriyle zarar verme şansı, doğrudan kristal elleçleme artık gerekli olmadığından önemli ölçüde azalır.

Introduction

Biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu yapısının bilgisi, tüm temel biyolojik, biyokimyasal ve Biyomedikal araştırmalarda önemli bir temel taş oluşturmaktadır. Bu bile bu tür araştırma, örneğin ilaç keşfi gibi belirli translasyonel yönleri uzanır. Atom çözünürlüğünde X-ışını Kristalografi bu tür üç boyutlu bilgi elde etmek için tüm yöntemler arasında en güçlü ve en belirgin biri olduğu gerçeğini tarafından kanıtlanmaktadır ki mevcut tüm yapısal bilgilerin% 90 X-ışını tarafından katkıda bulunulmuştur Kristalografi1. Aynı zamanda büyük bir sınırlama olan X-ışını kristalografinin ana ön koşulu, kırılması kaliteli kristallerin üretilmesi ve dikesleşme deneyi için hazırlanmasıdır. Bu adım hala yöntemin önemli darboğazları birini oluşturmaktadır.

Tarihsel olarak, protein kristallerinin dikeslik verileri ortam sıcaklığında toplandı. Bireysel kristaller dikkatle cam veya kuvars kapillaries veri toplama öncesinde transfer edildi, Anne likör kristaller kuru olmaz ve kapillaries mühürlü olduğunu, böylece kapiller eklendi2,3, 4‘ ü yapın. 1980 ‘ lerden bu yana, X-radyasyon iyonlaştırıcı özellikleri ve makromoleküler kristallerin yakın radyasyon hassasiyeti nedeniyle, ortam sıcaklığında veri toplama yöntemi üzerinde ciddi sınırlamalar teşkil daha belirgin oldu. Sonuç olarak, macromolekül kristalleri 100 K ‘ye kadar soğutarak radyasyon hasar etkilerini azaltmak ve bu kadar düşük sıcaklıkta5,6‘ da dikesleme verileri toplamak için yaklaşımlar geliştirilmiştir. Düşük sıcaklıklarda çalışmak için, numunelerin kapiller içinde montajı düşük ısı transferi oranı nedeniyle pratik hale gelmiştir. Buna rağmen, özellikle karşı difüzyon kristalizasyon deneyleri, düşük sıcaklık kısırlık çalışma7,8, ama, buna bakılmaksızın, kapillaries kullanmak için devam eden çabaları vardır, bu standart oldu ince bir kablolu döngü içinde anne likörü ince bir film tarafından tutulan makromoleküler kristaller monte etmek için makromoleküler Kristalografi yaklaşımı9,10. Bu döngü bazlı montaja zaman içinde bir dizi gelişme (örn. litografik döngüler ve benzeryapıların tanıtımı) zaman içinde yapılmış olsa da, 1990 ‘ ların başlarında geliştirilen temel ilkeler bugün hala kullanımda. Günümüzde makromoleküler kristallerin en fazla kırılacak veri koleksiyonlarının bugün hala bu yaklaşıma güvenmesini güvenli bir şekilde belirtmektedir5.

Zamanla, bazı ilginç yeni gelişmeler ve döngü tabanlı montaj yönteminin modifikasyonları vardı, ama bu yaklaşımlar şimdiye kadar toplumda yaygın olarak kabul edilmedi. Biri, alt arka plan saçılma12,13,14elde etmek için geliştirilen kristallerin sözde döngü daha az montaj olduğunu. Bir diğeri de kristalin örneklerini sarmak ve onları kurumadan korumak için grafen kılıfların kullanımı. Graphene çok düşük X-ışını saçılma arka plan15nedeniyle bu açıdan iyi uygun bir malzemedir.

Daha yakın zamanda, örnek bağlar alanında gelişmeler ağırlıklı olarak örnek verimlilik16 veya birden fazla örnek17, örneğin gibi tutabilir bağlar tasarlama, artan amacı ile bağlar standartlaştırılması üzerinde duruldu Silikon çerçevedeki desenli membranlarda, çoğunlukla seri Kristalografi18, 19,20,21,22alanında yüzlerce küçük kristalleri tutabilen.

Şimdiye kadar tartışılan örnek montaj yöntemlerinin tümü, numuneye mekanik hasara neden olan bir tehlike olduğu anlamına gelen manuel müdahalenin bir derecesini gerektirir. Bu nedenle, örnek ortamın mühendislik tarafından yeni yaklaşımlar aranır, böylece kristallerin kırılıyor verileri büyüme ortamlarında toplanabilir. Bu tür bir yöntem, situ veya plaka-tarama23,24 olarak adlandırılır ve zaten dünya çapında çeşitli senkrotron kaynaklardan makromoleküler Kristalografi beaylines bir dizi uygulanır25. Ancak, bu yöntemin kullanımı kristal plakanın geometrik parametreleri ve aracın örnek noktası etrafında kullanılabilir alan ile sınırlıdır.

Fakat CrystalDirect sistemi26‘ da başka bir yaklaşım gerçekleşir. Burada, tüm kristalizasyon damlaları otomatik olarak hasat edilir. Kristallerin yetiştirdiği folyolar, lazer kullanılarak özel olarak kesilmiş ve doğrudan örnek tutucu27olarak kullanılır.

Burada açıklanan iş, amaç bir örnek tutucusu geliştirmek oldu, hangi bir Kullanıcı dokunmak olmadan veri toplama cihazına kristalin örnek büyüme odasından taşımak için izin verecek ve hangi kullanıcı kolayca örnek manipüle sağlayacak. Makromoleküler Kristalografi alanında birçok araştırmacı, büyük tarama kampanyalarında belirlenen koşulları değiştirerek kristal büyümeyi optimize etmek için 24-iyi kristalizasyon formatını kullandığından, yeni örnek tutucu, Bu formatla uyumludur. Aşağıdaki şekilde, yeni örnek tutucunun tasarımı tarif edilecektir ve işleme ve örnek tutucu içinde situ veri toplama ve ligand ilikleme için performans gösterilecektir. Son olarak, bu yeni örnek sahibinin uygunluğu yanı sıra çeşitli çalışma adımları için sınırlamaları tartışılacaktır.

Protocol

Dikkat: sonraki tüm çalışmalar için, örnek tutucuya olası kontaminasyonlar nedeniyle, sarı renkli poliimid folyo korunmasız parmaklarla dokunulmamış olması çok önemlidir. Ayrıca, korunan forseps kullanımı şiddetle tavsiye edilir. 1. örnek tutucu Örnek tutucunun üç türünden birini kullanın.Not: yeni geliştirilen örnek tutucunun üç farklı sürümü Şekil 1′ de gösterilir. Hepsi bir siyah plastik destek yapısı, dışarıdan bir hava geçirmez COC folyo ve içinde gözenekli yapısal poliimid folyo içerir. Tip 1 (Şekil 1a) sabit bir dış plastik yüzük içeriyor, türler için ise 2 ve 3 (Şekil 1B,1C) dış yüzük otomatik örnek transfer sistemlerinde kullanılmak üzere belirlenmiş ilgili break noktalarında mekanik olarak kopuk olabilir (bkz. kırmızı Şekil 1B’de oklar). Örnek tutucular tasarım sarı poliimid folyo üzerinde birden kristalizasyon damla kurulumu sağlar. Malzeme görünür ışık için son derece şeffaf olduğu için, kristalizasyon deneyinin izlenmesi ödün vermez. 21 μm kalınlığında poliimid folyo de 5 μm gözenekler, daha sonra ıslatarak basit kristal manipülasyon sağlar. X-ışınlarının iletimi, makromoleküler Kristalografi içindeki tüm yaygın olarak kullanılan kırılma veri toplama enerjilerinin 1,0 ‘ e yakın olduğu için, folyonun bir kısırlık denemede arka planda saçılmaya katkısı28’ i ihmal edilebilir. 2. kristalizasyon damlaları ayarlama Nemli tüy bırakmayan bir bez kullanarak temiz ve tozsuz bir yüzey oluşturun. Kendi kutusundan bir örnek tutucu alın ve yavaşça yerleştirin, sarı folyo yukarı bakacak şekilde, temizlenmiş yüzeyde hasar veya arka COC folyo istenmeyen delinme önlemek için. Kristalizasyon damlalarını, yaygın olarak kullanılan kapak slaytlarında yapılması gerektiği gibi, sarı folyo üzerinde 2 μL ‘ye kadar önerilen maksimum hacimde ayarlayın. Bir pipet kullanarak herhangi bir rüptürü veya folyo delici önlemek için yavaşça damla yerleştirin. Tip 1 (Şekil 2a) bir örnek tutucu üzerinde üç damla konulabilir, ancak tip 2 ve 3 2 damla örnek sahipleri üzerinde önerilen maksimum (Şekil 2C). Örnek Tutucu üzerine çevirin ve 24-iyi Linbro tarzı plaka ön yağlanmış boşluğa yerleştirin. Yer belirleme yardımlarını kullanın ( Şekil 1a’da kırmızı okları görün), örnek tutucunun en uygun konumuna yönlendirin. İstenmeyen buharlaşma önlemek için örnek tutucu doğru konumunu emin olun (Şekil 2a). 3. Kristal büyümesini gözlemlemek Kristalizasyon plakasını kutuplu veya polarize olmayan bir şanzıman ışık mikroskobu altında koyarak, deney herhangi bir rahatsızlık olmadan kristal büyüme izleyin (Şekil 4). SBS ayak izi plakaları üzerinde kullanılmak üzere tasarlanmış tip 3 (Şekil 1C), daha küçük 18 mm örnek tutucular kullanırken, daha otomatik bir şekilde kristal büyümesini Izlemek için SBS ayak izi plakaları işleme yeteneğine sahip bir görüntüleme robotu kullanın. 4. Kristal manipülasyon Not: bir iletim ışık mikroskobu altında sonraki tüm adımları gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Cryo-koruma İnce kanül kullanarak dış COC folyo yavaşça delin. İç sarı folyo dokunulmamış kalır emin olun. Delinme, manipüle edilecek olan düşün hemen yanında olmalıdır (Şekil 3A,3c). İnce bir kağıt fitil kullanın ve dürte deliğe takın. Sarı poliimid folyo dokunur kadar dikkatle ileri fitil itin. Perfore folyo ile temas fitil tutun. Fitil tüm aşırı solüsyonu emecek. Tam sıvı çıkarılması için gereken süre, çözümlerin viskozitesine ve anne likör bileşimine (Şekil 3B) bağlıdır. Tüm sıvı uzaklaştırıldıktan sonra, yavaşça kağıt fitili geri çekin. Anne likörü kaldırıldıktan sonra görünür olmayabilir çünkü, damla konumunu unutmayın. Küçük bir miktar Cryo-protektan çözeltisi uygulamak için standart bir pipet alın, maks. 3 μL, aynı delikten bir ekstrüde ucu (örn. bir jel yükleme ucu) kullanarak. Sıvı dağıtılmış sonra, ucu geri çekin. Sarı folyo gözenekliliği folyo boyunca difüzyon sağlar. Kristallerin Cryo koruma elde etmek için zaman çok istihdam çözüm ve bileşenleri bağlıdır. Kendi kendine şifa COC folyo yeniden mühürlemek için, yavaşça yaklaşık 1 s için deliğe korumalı bir parmak yerleştirin ve delinme boyunca kaydırın. Yüksek sıcaklık ile birlikte hafif basınç çok büyük olmayan delinme, yeniden mühürleme teşvik edecektir. Ligand sırılsıklamNot: aşırı anne likörü ligand ıslanmadan önce kaldırılabilir. Bunu yapmak için 4.1.1 ile 4.1.3 arasında açıklanan adımları izleyin. Bir reaksiyon tüpü içinde istenilen konsantrasyonda anne likörü ligand çözülür. Çözünmez parçacıkları kaldırmak için 12.000 x g ‘de 10 dakika boyunca çözümü döndürün. Gerekirse sıcaklık kontrollü Santrifüjü kullanın. Hafifçe maksimum hacmi yerleştirin. COC folyo ile poliimid film arasındaki boşluğun uzun, ekstrüze Pipet ucunu kullanarak 3 μL ligand içeren solüsyon. Ucu geri çekin. Kendi kendine şifa COC folyo yeniden mühürlemek için, yavaşça yaklaşık 1 s için deliğe korumalı bir parmak yerleştirin ve delinme boyunca kaydırın (Ayrıca bkz 4.1.5). Membran boyunca difüzyon için izin vermek için bir süre için deney kulyur. Islatma süresi son derece difüzor çözeltisi ve bileşenleri29viskoziteye bağlıdır. Farklı ligin daha sonra emmek için birden çok kez 4.2.5 için 4.2.1 adımları yineleyin. 5. ortam sıcaklığında situ dikeslik veri toplama Not: solvent saçılma en aza indirmek için, veri toplama önce aşırı çözüm kaldırın. Önceden kurulan koşullar ile istikrarlı bir nem kontrollü beaminline ortam sağlamak30. Hafifçe forseps kullanarak belirlenmiş noktada şeffaf COC folyo kaldırın ve bir yoğurt bardağı ( Şekil 6B) kapağı kaldırmak istiyorsunuz gibi onu soyma. Numune tutucusunu yavaşça boşluğundan kaldırın ve hemen önceden hazırlanmış bir manyetik örnek tutucu tabanına takın. Bu adım için tutkal gerekmez (Şekil 6B). Örnek tutucunun taban içinde doğru konumlandırılmasını sağlamak için nazik basınç uygulayın. Örnek tutucuyu beaminline Goniyometre üzerine monte edin ve tutucunun doğru konumlandırılmasını sağlayın. Goniyometre geometrisine bağlı olarak, örnek tutucu, kırılacak deney sırasında herhangi bir gölgeleme neden olmadan 160 ° ‘ ye kadar döndürülebilir. Bir kağıt fitil kullanın ve yavaşça aşırı anne likörü kaldırmak için arka taraftaki sarı poliimid folyo dokunun. Lütfen dikkat, o aşamada ligand ilikinde veya Cryo-koruma sadece de yapılabilir. Örnek şimdi merkezleme ve kırıt veri toplama için hazırdır. Çıkarılabilir dış halka ile örnek bir tutucu kullanırken, dış halka üzerinde tutarak nazik basınç uygulayın ve belirlenmiş break noktalarında (Şekil 6C) kırın. Örnek şimdi merkezleme ve kırıt veri toplama için hazırdır. 6. kriyojenik sıcaklıkta situ dikeslik veri toplama Not: 4.1.1 adımlarını gerçekleştirerek örnekten kalan anne likörü kaldırmak için tavsiye edilir. 4.1.3 için. Solvent saçılma en aza indirmek için sonraki adımlara devam etmeden önce. Çoğu numune daha önce Cryo-Protection31olmadan sıvı nitrojeni aktarılabilir. Cryo-Protection gerekiyorsa, 4.1.1 adımlarına bakın. 4.1.5 için. COC folyoyu bir forseps kullanarak belirlenen noktada yavaşça kaldırın ve çıkarın (bkz. Adım 5.1.2) (Şekil 6a). Örnek tutucuyu boşluğun dışına çekin ve manyetik örnek tutucu tabanına bağlayın. Doğru ve sıkı bağlantı sağlamak için nazik basınç uygulanabilir (bkz. Adım 5.1.5, Şekil 6B).Not: simetrik olarak düzenlenmiş belirtilen break noktaları nazik basınç uygulayarak örnek tutucu dış halka basit kaldırılması için izin (bkz adım 5.1.8., Şekil 6C). Şimdi, örnek tutucu hazır ve sıvı nitrojen içine daldırılmış olabilir. Numune tutucu türlerinin 2 ve 3 geometrisi (Şekil 1B,1C), robot destekli numune MONTAJı için kullanılabilecek standart omurga numune şişeleri içine aktarılmasını sağlar (Şekil 6d).

Representative Results

Örnek tutucu tipi 1, 24-iyi Linbro stil plakasının bir kuyusu üzerine sığacağı şekilde tasarlanmıştır. Her bir örnek tutucu, kuyunun kenarına en uygun konumlandırma sağlamak için dış jantın her iki tarafındaki konumlandırma yardımcıları içerir (Şekil 1a, Şekil 2a). En fazla üç bireysel kristalizasyon damla maksimum hacim 2 μL sarı poliimid folyo üzerine yerleştirilebilir (Şekil 2B). 2 ve 3 tipindeki örnek tutucular için, her biri en fazla iki damla maksimum hacim 2 μL ayarlamanız önerilir. 24 örnek tutucu 1 24 üzerine takılabilir-iyi Linbro plaka (şekil 3D). Örnek tutucu tip 1 kullanarak 24-iyi Linbro plaka üzerinde bir kristalizasyon deneyi kuruldu. 1 μL tavuk yumurtası-beyaz lizozim çözeltisi (15 mg/ml), örnek tutucu üzerinde sarı poliimid folyo üzerinde 50 mm NAAC pH 4,7, 500 mm NaCl ve% 25 (w/v) Peg-6000 içeren 1 μL anne-likörü ile karıştırıldı (Tablo 1). Damlası 293 K ‘de 500 μL ‘ye karşı dengelenmiş ve 5 saat sonra 40-50 μm büyüklüğünde kristaller görüldü (Şekil 4). Kristal büyüme, bir polarizer ile veya olmadan bir iletim ışık mikroskop (Şekil 4) kullanılarak görülebilir. Yüksek şeffaflık filmleri, hem konvansiyonel ışık mikroskobu hem de otomatik kristal görüntüleme sistemi kullanarak kristal büyüyen koşulların en iyi şekilde izlenmesi ve izlenmesini sağlar. UV-Light kullanarak kristal büyüme gözlem test edilmedi. Kristallerin etrafında anne likörü çıkardıktan sonra, tavuk yumurtası-beyaz lizozim kristalleri ile bir örnek tutucu kristalizasyon plakasını alındı ve HZB-MX beayline 14,332üzerinde bir nem kontrollü Airstream yerleştirilir. 4 x 1010 Foton/s ve görüntü başına 5 s pozlama süresi Ile 13,8 Kev enerjisiyle 150 μm ışın kullanılarak 1 ° artışlarla ortam sıcaklığında kırıklama verileri toplandı. Şekil 5’ te tipik bir kırınım görüntüsü gösterilir. Kırılma görüntüsünde yükseltilmiş arka plan saçılması algılanamaz. Diğer deneysel Ayrıntılar yanı sıra ilişkili veri işleme istatistikleri Tablo 2listelenir. Şekil 1 : Yeni numune tutucuların şematik görünümü. Örnek tutucular, bir amorf döngüsel olefin kopolimer (COC) folyo ile dış tarafında kaplı bir siyah plastik destek oluşur. Bu folyo (mavi renkli) son derece şeffaf ve kendini iyileştiriyor. Ayrıca deneyde gaz sıkılığı sağlar. İç folyo (sarı renkli), X-ışınları için son derece şeffaf olan biyo-inert Polyimide yapılır. Bu folyo üzerinde kristalizasyon damlaları yerleştirilebilir. Örnek tutucunun dış kenarı, kırmızı ok (panel A) ile gösterilen iki konumlandırma yardımı içerir ve bu da örnek tutucunun kristalizasyon plakasının bireysel önceden yağlanmış boşluğuna doğru yerleştirilmesi sağlar. (A) sabit harici destek halkası ile 22 mm çapına sahip örnek tutucu (tip 1). (B) çıkarılabilir dış destek halkası ile 22 mm çapında örnek tutucu (tip 2). (C) çıkarılabilir dış destek halkası ile 18 mm çapında örnek tutucu (tip 3). İkinci iki, omurga standardı kullanılarak otomatik örnek montaj robotlar ile yüksek verim moda onları kullanmak için geliştirilmiştir. Belirlenmiş break noktaları, Bpanelindeki kırmızı oklar ile vurgulanır. C panelindeki siyah ok konumlandırma işaretçisini gösterir. Sarı folyo dış çevresindeki çıkıntılı iğneler üretim sürecinde poliimid folyo hizalamak için gereklidir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 2 : Örnek tutucu, yaygın olarak kullanılan mikroskop kapak kuponları ile aynı şekilde 24-Iyi Linbro plaka üzerinde kullanılabilir. Bu boşluğu hava geçirmez mühürler. Konumlandırma yardımları, örnek tutucunun boşlukta doğru konumlandırılmasını sağlar ( Apanelinde kırmızı oklar). Bir tip 1 örnek tutucu (panel B) üzerine üç ayrı damla konulabilir, ancak bir tip 2 veya 3 örnek tutucuya yerleştirilen önerilen maksimum damla sayısı iki ‘ dir. Her damla için önerilen maksimum birim 2 μL ‘dir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın . Şekil 3 : 24 Tip 1 örnek tutucu 24-kuyu plakasına sığar. Örnek tutucular, 24-kuyu plakasına belirtildiği gibi iki oryantasyon halinde yerleştirilebilir (panel D). Bir kanül, bir kristalizasyon düşüşü (paneller a ve C) aşırı likörü hafifçe aynı deliğe (panel B) takılı bir kağıt FITIL kullanarak kaldırmak için arka COC folyo delmek için kullanılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 4 : Bir polarize ile donatılmış bir iletim mikroskop aracılığıyla gözlenen tavuk yumurta-beyaz lizozim kristalleri görüntüsü. Bireysel kristaller kolayca çöktürülmüş protein çözeltisi ayrımcılık vardır. Bu görüntüdeki kristaller ortalama 40 μm x 50 μm boyutudur. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .  Şekil 5 : Örnek tutucu üzerinde yetiştirilen bir lizozim kristali tipik bir X-ışını dikesisi görüntü. X-ışınlarına maruz kalmadan önce tüm aşırı anne likörü kristalin etrafında çıkarıldı. BESSY II32 ,% 97,5 bağıl nemden dolayı nem kontrollü bir örnek ortam kullanarak, Bl 14.3 üzerinde ortam sıcaklığında kırıklık verileri toplanır. Örnek tutucuları nedeniyle yükseltilmiş arka plan yok gözlenebilir. Görüntüdeki kesikli çizgiler çözünürlük halkaları gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 6 : Örnek tutucu, kırınım veri toplama için hazırlanmıştır. İlk olarak, COC film yavaşça bir forseps kullanarak kaldırılır ve sonra (panel a) soyulmuş. Daha sonra, örnek tutucu boşluğdan çıkarılır ve marker (panel B) tarafından belirtilene kadar manyetik üssün merkezi deliğine yerleştirilir. Merkezi parçaya tutarak, simetrik olarak düzenlenmiş belirlenmiş break noktaları (panel C) kullanarak merkezi parçayı boşaltmak için dış halka yumuşak basınç uygulanır. Kaldırıldıktan sonra, örnek tutucu sıvı nitrojen içine daldırılmış ve standart omurga şişeleri transfer edilebilir. Örneğin, Montajlarda, otomatik örnek montaj robotlarının bunları düzenli örnekler (panel D) olarak tanıyabileceği senkrotron sitelerine taşınabilirler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.  Kristalizasyon detayları Yöntem Asılı damla, buhar difüzyon yöntemi Plaka tipi SuperClear levhalar Sıcaklık (K) 293 Protein konsantrasyonu (mg mL-1) 15 Rezervuar çözeltisi bileşimi 50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl,% 25 (w/v) PEG-6000 Hacim ve düşüş oranı 2 μL toplam, 1:1 oranı (protein: Anne likörü Rezervuar hacmi 500 (μL) İnkübasyon süresi 12 saat sonra Tablo 1: açıklanan kristalizasyon denemenin deneysel detayları. Veri toplama ve işleme Dalga boyu (Å) 0,89429 Sıcaklık (K) 293 Dedektörü Rayonix MX225 CCD Kristal Dedektör mesafesi (mm) 120 Görüntü başına döndürme aralığı (°) 0,5 Toplam rotasyon aralığı (°) 120 Görüntü (ler) başına pozlama süresi 5 Uzay grubu P43212 Birim hücre parametreleri (Å) a = 79,01, b = 79,01, c = 37,95 Mosacity (°) 0,07 Çözünürlük aralığı (Å) 39,50-1,35 (1,37-1,35) Toplam yansıma sayısı 191940 (8932) Benzersiz yansımaların sayısı 27020 (1292) Bütünlüğü (%) 99,88 (99,20) Multiplicity 7,1 (6,9) Mean ı/σ (ı) 15,0 (1,9) RMeas35 (%) 6,3 (107,0) RPIM36 (%) 2,4 (40,4) CC1/237  99,9 (68,5) ISa38 16,1 Wilson B faktörü (Å2) 17,0 Tablo 2: Dikesleme veri toplama ve işleme istatistikleri.

Discussion

Kristalizasyon deneylerine uygunluk. Yeni örnek sahipleri standart asılı damla kristalizasyon deneyler 24-iyi Linbro tip plakaları (türleri 1 ve 2) veya 24-iyi SBS ayak izi plakaları, her iyi bir çapı 18 mm (tip 3) kullanarak kullanılabilir. Standart mikroskop kapak kuponları yerine kullanılabilir. Amorf COC folyo sistemin hava sızdırmazlığını sağlar. Kristalizasyon deneyinin izlenmesi, yüksek netlik folyoları kullanımı nedeniyle bir iletim ışığı mikroskobu kullanılarak mümkündür. Bilgimizin en iyisi için, diğer örnek sahipleri 24-iyi kristalizasyon plakaları için var, hangi kristal manipülasyon veya kırılması deneyler izin verecek, mekanik düşmeden kristal çıkarmadan, hangi o büyüdü. Bu özellikle önem taşımaktadır, çünkü alanda birçok araştırmacı hala kristal optimizasyonu için bu tür plakalar güveniyor, daha büyük damla hacimleri 96 ile karşılaştırıldığında kullanılabilir nedeniyle-iyi oturma-damla plakaları. Bu büyük damla hacimleri ile daha büyük kristaller elde edilebilir.

Kristal manipülasyon uygunluğu. Dış COC folyo ve iç sarı poliimid folyo mikrogözenekli yapısı kendi kendine iyileştirici özellikleri nedeniyle, kristal çevre erişilebilir ve kristaller mekanik olarak diğer konteynerlere transfer olmadan manipüle edilebilir. Bu örnek sahipleri çok uygun hale getirir. Kristale Bu dolaylı ve nazik erişim sağlayan bildiğimiz tek sistem, CrystalDirect sistemi26‘ dir. Ancak, CrystalDirect özel 96-iyi kristalizasyon plakaları kullanılması gerektiğinden daha az esnektir. Kristallerin büyüyen folyo, kristalizasyon deneyi mühürler ve kendini iyileştirme değildir aynıdır. Bu, kristaller için ligor veya Cryo-protektan teslim için lazer ablasyon tarafından folyo içine delinmiş olan bir diyafram açık kalacaktır, sıvı buharlaşma şansını artırarak anlamına gelir. Bu bizim tasarım aksine, nerede kristaller doğrudan çevreye maruz olmayacaktır bile COC folyo zaman bir dizi deldi alır.

Ortam sıcaklığında in situ dikeslik deneylerinin uygunluğu. Örnek tutucu, kristalizasyon plakasının düz ileri bir şekilde çıkarılabilir, bir manyetik baz üzerine sıkışmış ve bir Beam hattı Goniometer koymak. Oda sıcaklığında bir kırılması deneyi için, örnek tanımlanan nem33bir hava akışına koymak tavsiye edilir. Kristalin etrafında anne likör arka plan saçılma azaltmak için Goniyometre örnek tutucu koyarak önce kaldırılabilir. Böyle bir set-up saatler için kararlı.

100 K. ‘ de kullanım ve depolama için kullanılan malzemenin uygunluğu. Ne numune tutucu ne de poliimid film üretimi için kullanılan malzeme düşük sıcaklıklarda34onları soğutarak olumsuz etkilenir. Bu nedenle, düşük sıcaklıkta örnek tutucu ile çalışma (örneğin, 100 K) ciddi bir sorun teşkil etmez.

100 K. ‘ de situ kırınım deneylerinin uygunluğu 100 K ‘de bir nitrojen akışında veri toplama için, örnek tutucu bir önceki paragrafta olduğu gibi kristalizasyon plakasının çıkarılması gerekir, bir manyetik baz üzerine sıkışmış ve bir gazlı nitrojen akışı içine koymak 100 K bir Beam hattı Goniometer üzerinde. İstenirse, örnek de Cryo korumalı olabilir, ancak büyük olasılıkla bu çıplak örnekler için bu gerekli olmayabilir çoğu durumda31. 100 K ‘de deneyler için, dış plastik yüzük çıkarıldığından, örnek tutucular tip 2 ve 3 daha uygundur. Bu nedenle, daha küçük boyutta ve bu nedenle daha az buzlanma eğilimli olmalıdır. Ancak, tip 1 bile bir örnek sahibi kullanılabilir. Deneysel barakada bir çok yüksek nem ve tutucunun düzgün hizalanmış Cryo-sistemi buzlanma gerçekten bir sorun değildir.

Sınırlamalar. Örnek tutucu geometrisi, 160 ° ‘ lik toplam döndürme aralığı üzerinden dönme yöntemine göre engelsiz kırkın veri toplamasını sağlar. Çoğu kristal sistem için tam kırılacak veri kümeleri elde edilebilir, böylece bu yeterlidir. Bu mümkün olmadığı durumlarda, kristal daha fazla veri birlikte birleştirilmesi gerekir. Kristaller bir araya geldiğinde, olay X-ışını ışını boyutunu ayarlamak mümkün olabilir, böylece bireysel kristallerin sadece parçaları maruz kalır. Aşırı durumlarda, bir veri toplama stratejisi MeshAndCollect yaklaşımı35benzer başvurmak gerekebilir. Özetle, örnek sahipleri ile ilişkili belirli sınırlamalar varken, bunlar çoğu durumda üstesinden gelebilir. Tabii ki, bu durumların hiçbiri mümkün değildir karşılaşılan her zaman mümkündür. Bu gibi durumlarda, bir diğer kristal montaj yöntemleri başvurmak gerekebilir.

Macromoleküler Kristalografi için örnek tutucu yeni bir tip tarif ettik ve biz çeşitli uygulamalar için numune sahipleri uygunluğu göstermiştir. Protein kristallerinin basit ve tekrarlanabilir şekilde işlenmesini ve örnek sahiplerinin benzersiz özelliklerini dikkate alarak, bu örnek sahiplerinin makromoleküler için numune sahiplerinin cephaneliği için değerli bir ek olduğunu kanıtlayacağı inanıyoruz. Kristalografi.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar BESSY II, Helmholtz-Zentrum Berlin tarafından kiriş zaman erişim ve destek için işletilen teşekkür etmek istiyorum, ve tasarım ve inşaat ve 3D-yazıcı tesisleri erişimi ile yardım için örnek çevre ve teknik tasarım bölümleri.

Materials

AF Satetiss RS Components 101-5738 lint-free paper, multiple retailer
Cannula Dispomed Neoject 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 multiple retailer
COC foil HJ-Bioanalytik GmbH 900360
ComboPlate Greiner Bio-one / Jena Bioscience 662050 / CPL-131 pre-greased plate, multiple retailer
Cryo Vials Jena Bioscience CV-100
Eppendorf Research Plus  Eppendorf 3123000012 0.1 – 2.5 µL volume
Eppendorf Tubes Eppendorf 30125150 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number
Forceps Usbeck FisherScientific 10750313
GELoader Eppendorf Quality Eppendorf 30001222 extruded  tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number
Magnetic CryoVials Molecular Dimension MD7-402
Microfuge Thermo ThermoFisher Scientific R21
Paper wicks dental2000 64460 Set of paper wicks, multiple retailer
Rotiprotect Nitril-eco  Carl Roth TC14.1 powder free, multiple retailer
SuperClear Plates Jena Bioscience CPL-132 pre-greased plate
UHU super glue UHU GmbH & Co KG 45545 manufacturer reference number, multiple retailer
VeroBlackPlus Alphacam OBJ-40963 manufacturer reference number
XtalTool  Jena Bioscience X-XT-101 sample holder set
XtalTool HT Jena Bioscience X-XT-103 / X-XT-104 SPINE compatible sample holder set
XtalToolBases Jena Bioscience X-XT-105 Magnetic sample holder bases set
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  2. Mac Sweeney, A., D’Arcy, A. A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature. Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).
  3. Kalinin, Y., et al. A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography. Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).
  4. Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).
  5. Pflugrath, J. W. Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures. Methods. 34 (3), 415-423 (2004).
  6. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  7. Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).
  8. Martínez-Rodríguez, S., et al. Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).
  9. Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
  10. Teng, T. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  11. Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O’Neill, K., Gillilan, R. Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).
  12. Jian-Xun, Q., Fan, J. An improved loopless mounting method for cryocrystallography. Chinese Physics B. 19 (1), 010601 (2010).
  13. Kitatani, T., et al. New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material. Applied Physics Express. 1 (3), 037002 (2008).
  14. Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).
  15. Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter. Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).
  16. Parkin, S., Hope, H. Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals. Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).
  17. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  18. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5, 10451 (2015).
  19. Roedig, P., et al. Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).
  20. Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).
  21. Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
  22. Feld, G. K., et al. Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).
  23. le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).
  24. Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).
  25. Aller, P., et al. Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).
  26. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).
  27. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  28. Antimonov, M., et al. Large-area Kapton x-ray windows. Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F (2015).
  29. McPherson, A. Penetration of dyes into protein crystals. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).
  30. Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. Raoult’s law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).
  31. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary?. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).
  32. Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
  33. Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
  34. Yano, O., Yamaoka, H. Cryogenic properties of polymers. Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).
  35. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).

Tags

Macromolecular X-ray CrystallographySample Holder24-well PlateMinimal Background ScatteringCrystal Growth MonitoringCryoprotectionPaper WickCOC FoilPolyimide Foil

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, M. S. An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering. J. Vis. Exp. (149), e59722, doi:10.3791/59722 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image