최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더
Summary
적절한 처리 프로토콜과 함께 거대 분자 X 선 결정학을위한 새로운 샘플 홀더가 제공됩니다. 이 시스템은 결정 조작이나 장착없이 주변 및 극저온 온도모두에서 결정 성장, 크리스탈 흡수 및 비지석 회절 데이터 수집을 허용합니다.
Abstract
거대 분자 X 선 결정학 (MX)은 생물학적 거대 분자의 고해상도 3 차원 지식을 얻는 가장 눈에 띄는 방법입니다. 이 방법의 전제 조건은 고도로 정렬된 결정성 시편을 연구하기 위해 거대 분자로부터 성장해야 하며, 회절 실험을 위해 준비되어야 한다는 것입니다. 이러한 제제 절차는 전형적으로 재배된 용액으로부터 크리스탈을 제거하고, 리간드 용액 또는 저온 보호액에 크리스탈을 담근 다음 실험에 적합한 마운트상에서 결정을 고정시키는 것을 포함한다. 이 절차의 심각한 문제는 거대 분자 결정이 종종 기계적으로 불안정하고 오히려 깨지기 쉽다는 것입니다. 따라서 이러한 깨지기 쉬운 결정의 처리는 구조 결정 시도에서 병목 현상이 쉽게 될 수 있습니다. 이러한 섬세한 결정에 가해지는 모든 기계적 힘은 분자의 규칙적인 포장을 방해할 수 있으며 결정의 회절 력 의 손실로 이어질 수 있습니다. 여기에서는 결정의 처리 단계를 최소화하고 따라서 구조 결정 실험의 성공률을 극대화하기 위해 개발된 새로운 올인원 샘플 홀더를 제시합니다. 샘플 홀더는 일반적으로 사용되는 현미경 커버 슬립을 대체하여 크리스탈 방울의 설정을 지원합니다. 또한, 결정화 공동의 개방없이 결정화 캐비티의 개방없이 리간드 담그기, 저온 보호 및 복잡한 형성과 같은 장소 의 결정 조작을 허용합니다. 마지막으로, 시료 홀더는 주변 및 극저온 모두에서 현장에서 X선 회절 데이터를 수집할 수 있도록 설계되었습니다. 이 샘플 홀더를 사용하면 직접 결정 처리가 더 이상 필요하지 않으므로 결정화에서 회절 데이터 수집에 이르는 과정에서 결정이 손상될 가능성이 상당히 줄어듭니다.
Introduction
생물학적 거대 분자의 3차원 구조에 대한 지식은 모든 기본적인 생물학적, 생화학적 및 생의학 연구에서 중요한 초석을 구성합니다. 이것은 예를 들면 약 발견과 같은 그 같은 연구의 특정 번역 양상까지 확장합니다. 원자 해상도 X 선 결정학에서 이러한 3 차원 정보를 얻기위한 모든 방법 중 가장 강력하고 가장 눈에 띄는 하나는 사용 가능한 모든 구조 정보의 90 %가 X 선에 의해 기여된다는 사실에 의해 입증된다 결정학1. X선 결정학의 주요 전제 조건은 회절 품질의 결정이 회절 실험을 위해 생산되고 준비되어야 한다는 것입니다. 이 단계는 여전히 메서드의 주요 병목 현상 중 하나입니다.
역사적으로, 단백질 결정으로부터의 회절 데이터는 주변 온도에서 수집되었다. 개별 결정은 신중하게 데이터 수집 전에 유리 또는 석영 모세 혈관으로 전달, 모술을 건조하지 않도록 모세 혈관에 첨가하고 모세 혈관을 밀봉했다2,3, 4. 1980 년대 이후, X-방사선의 이온화 특성과 거대 분자 결정의 임박한 방사선 감도로 인해 주변 온도에서의 데이터 수집이 방법에 심각한 제한을 초래한다는 것이 점점 더 명백해졌습니다. 그 결과, 거대 분자 결정을 100K까지 냉각하여 방사선 손상 효과를 완화하고 저온5,6에서회절 데이터를 수집하기 위한 접근법이 개발되었습니다. 저온에서 작업할 때, 모세혈관에 시료를 장착하는 것은 열 전달속도가 낮기 때문에 실용적이지 해졌습니다. 그럼에도 불구하고, 특히 반확산 결정화 실험에서 모세혈관을 사용하기 위한 노력이 계속되고 있으며, 저온 회절작업 7,8,그러나 그에 관계없이 표준이 되었습니다. 거시 분자 결정학에 접근하여 얇은 유선 루프9,10내부에 어머니 주류의 박막에 의해 보유 된 거대 분자 결정을 장착합니다. 이 루프 기반 마운팅에 시간이 지남에 따라 많은 개선(예:리소그래피 루프 및 유사한 구조 11)이 도입되었음에도 불구하고 1990년대 초에 개발된 기본 원칙은 오늘날에도 여전히 사용되고 있습니다. 그것은 안전하게 요즘 거대 분자 결정에 대부분의 회절 데이터 수집이 접근 에 의존 한다는 것을 진술 할 수있다5.
시간이 지남에 따라 루프 기반 장착 방법의 몇 가지 흥미로운 새로운 개발 및 수정이 있었지만 이러한 접근 방식은 지금까지 커뮤니티에서 널리 채택되지 않았습니다. 하나는 낮은 배경 산란12,13,14를달성하기 위해 개발 된 결정의 소위 루프리스 장착이다. 또 다른 하나는 결정성 견본을 감싸고 건조에서 그(것)들을 보호하기 위하여 그래핀 칼집의 사용입니다. 그래 핀은 매우 낮은 X 선 산란 배경(15)때문에 그 점에서 잘 적합한 재료이다.
최근에는 시료 처리량16을 늘리거나 하나 이상의 샘플17을보유할 수 있는 마운트 를 설계하는 것을 목표로 주로 시료 마운트 분야의 개발이 집중되었습니다. 실리콘 프레임에 패턴 멤브레인, 이는 주로 직렬 결정학 의 분야에서 작은 결정의 수백을 보유 할 수있다18,19,20,21,22.
지금까지 논의된 모든 시료 장착 방법은 여전히 어느 정도의 수동 개입이 필요하며, 이는 시료에 기계적 손상을 일으킬 위험이 내재되어 있음을 의미합니다. 따라서, 결정의 회절 데이터가 그들의 성장 환경 내에서 수집 될 수 있도록 샘플 환경을 엔지니어링하여 새로운 접근 방식을 모색하고있다. 이러한 방법 중 하나는 23,24 에서 지칭되며, 이미 전 세계 다양한 싱크로트론 소스에서 다수의 거대 분자 결정학 빔라인에서 구현되고있다25. 그러나, 이 방법의 사용은 결정 판의 기하학적 파라미터및 계측기의 샘플 포인트 주위에 이용 가능한 공간에 의해 제한된다.
그러나 또 다른 방법은 소위 CrystalDirect 시스템26에서실현된다. 여기서, 전체 결정화 방울은 자동으로 수확된다. 결정이 성장된 포일은 레이저를 사용하여 맞춤 절단되고 샘플홀더(27)로직접 사용됩니다.
여기에 설명된 작업에서, 목적은 사용자가 그것을 건드리지 않고 데이터 수집 장치로 성장 챔버에서 결정성 샘플을 이동하고 사용자가 쉽게 샘플을 조작 할 수 있도록 하는 샘플 홀더를 개발하는 것이었습니다. 거대 분자 결정학 분야의 많은 연구원들이 여전히 대규모 선별 캠페인에서 확인된 조건을 수정하여 결정 성장을 최적화하기 위해 24웰 결정화 형식을 사용하고 있기 때문에 새로운 샘플 홀더는 이 형식과 호환됩니다. 이하에서, 새로운 샘플 홀더의 설계에 대해 설명하고, 시립 데이터 수집 및 리간드 담그기시 샘플 홀더의 취급 및 성능을 입증할 것이다. 마지막으로, 이 새로운 샘플 홀더의 적합성과 다양한 작업 단계에 대한 제한 사항에 대해 논의할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
결정화 실험에 대한 적합성. 새로운 샘플 홀더는 24웰 Linbro 형 플레이트(유형 1 및 2) 또는 각 웰의 직경이 18mm(유형 3)인 24웰 SBS 풋프린트 플레이트를 사용하는 표준 매달려 있는 낙하 결정화 실험에 사용할 수 있습니다. 표준 현미경 커버 슬립 대신 사용할 수 있습니다. 비정질 COC 호일은 시스템의 기밀성을 보장합니다. 결정화 실험의 모니터링은 높은 선명도 의 호일을 사용하기 때문에 투과 광 현미경을 사용하여 가능하다. 우리가 아는 한, 24웰 결정화 플레이트에는 다른 시료 홀더가 존재하지 않으며, 이는 결정 조작 또는 회절 실험을 기계적으로 제거하지 않고, 재배되는 낙하물에서 결정을 제거하지 않고도 허용됩니다. 이것은 특히 중요 한, 현장에서 많은 연구자 여전히 크리스탈 최적화에 대 한 이러한 플레이트에 의존 하기 때문에, 때문에 더 큰 드롭 볼륨 96 잘 앉아 드롭 플레이트에 비해 사용할 수 있습니다. 이러한 더 큰 낙하 부피를 사용하면 더 큰 결정이 얻어질 수 있습니다.
크리스탈 조작에 대한 적합성. 외부 COC 호일의 자가 치유 특성과 내부 노란색 폴리이미드 호일의 미세 다공성 구조로 인해 결정 환경에 접근 할 수 있으며 결정은 기계적으로 다른 용기로 옮기지 않고 조작 할 수 있습니다. 따라서 샘플 홀더가 매우 편리합니다. 우리가 알고있는 유일한 다른 시스템은 크리스탈에 대한 간접적이고 부드러운 액세스를 허용하는CrystalDirect 시스템 26입니다. 그러나 CrystalDirect는 특수 96웰 결정화 플레이트를 사용해야 하기 때문에 유연성이 낮습니다. 결정이 자라는 호일은 결정화 실험을 밀봉하는 것과 동일하며 자가 치유가 아닙니다. 즉, 리간드 또는 극저온 보호제 전달을 위해 레이저 절제에 의해 호일로 관통된 조리개가 열려 있어 액체 증발 가능성이 높아집니다. 이는 COC 호일이 여러 번 관통되더라도 결정이 환경에 직접 노출되지 않는 우리의 디자인과는 대조적입니다.
주변 온도에서의 회절 실험에 대한 적합성. 샘플 홀더는 직선 으로 결정화 플레이트에서 제거 할 수 있습니다, 자기 베이스에 붙어 빔 라인 고니 오미터에 넣어. 실온에서회절 실험의 경우, 샘플을 정의된습도(33)의공기 흐름에 넣는 것이 바람직하다. 결정 주위의 모주류는 배경 산란을 감소시키기 위해 샘플 홀더를 고니오미터상에 놓기 전에 제거될 수 있다. 이러한 설정은 몇 시간 동안 안정적입니다.
100K에서 작동 및 보관에 사용되는 재료의적합성. 시료 홀더의 생산에 사용되는 재료나 폴리이미드 필름은 저온34로냉각하여 부정적인 영향을 받지 않습니다. 따라서 저온(예: 100K)에서 샘플 홀더로 작업하는 것은 심각한 문제를 제기하지 않습니다.
100 K에서 의 회절 실험에 대한 적합성. 질소 스트림에서 100K에서 데이터 수집을 위해 샘플 홀더는 이전 단락에서와 같이 결정화 플레이트에서 제거되어야 하며, 자기 베이스에 붙어 빔라인 고니오미터에서 100K의 기체 질소 스트림에 넣어야 합니다. 원하는 경우, 샘플은 또한 저온 보호 될 수있다, 그것은 벌거 벗은 샘플이 대부분의 경우31필요하지 않을 수 있지만. 100K에서의 실험의 경우 외부 플라스틱 링을 제거할 수 있기 때문에 샘플 홀더 유형 2와 3이 더 적합합니다. 따라서, 그들은 더 작은 크기이며, 따라서 착빙에 덜 수있어야합니다. 그러나, 타입 1의 샘플 홀더도 사용될 수 있다. 실험 오두막에서 너무 높은 습도를 감안할 때 홀더의 제대로 정렬 된 저온 시스템 결빙은 실제로 문제가되지 않습니다.
제한 사항. 샘플 홀더의 형상은 총 회전 범위 160°에 걸쳐 회전 방법으로 방해받지 않는 회절 데이터 수집을 허용합니다. 이는 대부분의 결정 시스템에서 완전한 회절 데이터 세트를 얻을 수 있도록 충분합니다. 이것이 불가능한 경우, 크리스탈 이상의 데이터를 함께 병합해야 합니다. 결정이 함께 성장하면 개별 결정의 일부만 노출되도록 입사형 X선 빔의 크기를 조정할 수 있습니다. 극단적인 경우에는 MeshAndCollect 접근 방식35와유사한 데이터 수집 전략에 의존해야 할 수 있습니다. 요약하면, 샘플 홀더와 관련된 특정 제한 사항이 있지만 대부분의 경우 이러한 제한사항을 극복할 수 있습니다. 물론, 상황이 발생할 수 있습니다, 이 중 어느 것도 가능하지 않습니다. 이러한 경우 다른 크리스탈 장착 방법에 의존해야 할 수도 있습니다.
우리는 거대 분자 결정학을 위한 견본 홀더의 새로운 모형을 기술하고 우리는 각종 응용을 위한 견본 홀더의 적합성을 설명했습니다. 단백질 결정의 간단하고 재현 가능한 취급과 샘플 홀더의 고유한 특성을 고려하여, 우리는 이 샘플 홀더가 거대 분자용 샘플 홀더의 무기고에 귀중한 추가될 것이라고 믿습니다. 결정학.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 헬름홀츠-젠트럼 베를린이 운영하는 BESSY II와 3D 프린터 시설에 대한 설계 및 시공 에 대한 도움을 준 샘플 환경 및 기술 설계 부서에 감사드립니다.
Materials
| AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
| Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
| COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
| ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
| Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
| Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 – 2.5 µL volume |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
| Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
| GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number |
| Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
| Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
| Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
| Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
| SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
| UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
| VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
| XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
| XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
| XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |
Riferimenti
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