背景散乱を最小限に抑えた高分子X線結晶学用オールインワンサンプルホルダー

注意:後続のすべての作業では、サンプルホルダーへの汚染の可能性があるため、黄色のポリイミド箔を保護されていない指で触れてはならないことが非常に重要です。また、保護された鉗子の使用を強くお勧めします。 1. サンプルホルダー 3種類のサンプルホルダーのいずれかを使用します。注: 新開発サンプルホルダーの 3 つの異なるバージョンを図 1に示します。それらのすべては、黒いプラスチックサポート構造、外側に気密COC箔、内側に微多孔構造ポリイミド箔が含まれています。タイプ1(図1A)には固定された外側のプラスチックリングが含まれていますが、タイプ2および3(図1B、1C)の場合、外輪は自動サンプル搬送システムで使用するために指定されたそれぞれのブレークポイントで機械的に切断することができます(赤色を参照)。図 1Bの矢印)。サンプルホルダーの設計は黄色のポリイミド箔の複数の結晶化の滴の組み立てを可能にする。材料は可視光に対して非常に透明であるため、結晶化実験の監視を損ないません。21 μmの厚いポリイミド箔はまた5 μmの気孔を特色にし、後で浸すことによって簡単な結晶操作を可能にする。X線の透過は、高分子結晶学において一般的に使用される回折データ収集エネルギーにおいて全て1.0に近いため、回折実験における背景散乱に対する箔の寄与はごくわずか28である。 2. 結晶化ドロップの設定 湿った糸くずのない布を使用して、清潔でほこりのない表面を作成します。箱からサンプルホルダーを1つ取り出し、黄色い箔を上向きにして、裏側のCOCホイルの損傷や不要な穿刺を避けるために、清潔な表面にそっと置きます。 一般的に使用されるカバースライドで行われるように、黄色の箔に最大推奨体積2μLの結晶化滴を設定します。ピペットを使用してホイルの破裂やピアスを避けるために、滴を穏やかに置きます。タイプ1(図2A)のサンプルホルダーには最大3滴を配置できますが、タイプ2と3のサンプルホルダーには推奨最大値(図2C)があります。 サンプルホルダーを裏返し、24ウェルのリンブロスタイルのプレートのプレグリース付きキャビティに置きます。サンプルホルダーの位置補助具(図1Aの赤い矢印を参照)を使用して、最適な位置に導きます。 不要な蒸発を避けるために、サンプルホルダーの正しい位置を確認してください(図2A)。 3. 結晶成長の観察 透過光顕微鏡の下に結晶化板を配置することにより、偏光器の有無にかかわらず、実験の妨害なしに結晶成長を監視する(図4)。 SBSフットプリントプレートで使用するために設計されたタイプ3(図1C)の小型の18mmサンプルホルダーを使用する場合は、SBSフットプリントプレートを処理できるイメージングロボットを使用して、より自動化された方法で結晶の成長を監視します。 4. 結晶操作 注:透過光顕微鏡の下で後続のすべてのステップを実行することをお勧めします。 クライオ保護 細かいカニューレを使用して外側のCOC箔をそっと突き刺します。内側の黄色の箔が手つかずのままであることを確認します。穿刺は、操作されるドロップのすぐ隣にある必要があります (図3A,3C)。 細かい紙の芯を使用し、突き穴に挿入します。黄色のポリイミドホイルに触れるまで、芯を慎重に前方に押します。芯は穿き付いたホイルと接触しておいてください。芯は、すべての余分な溶液を吸い取ります。完全な液体除去に要する時間は、溶液および母液組成物の粘度に依存する(図3B)。 すべての液体が吸い取られた後、ゆっくりと紙の芯を引き込みます。それは母酒の除去後に見えないかもしれないので、ドロップの位置を覚えておいてください。 標準的なピペットを取り、クライオ保護溶液の少量、最大を適用します。3 μL、押し出された先端(例えば、ゲルローディングチップ)を使用して、同じ穴を通す。液体が分配されたら、先端を引き込みます。黄色の箔の多孔性は、箔全体に拡散を可能にします。あなたの結晶の凍結保護を達成する時間は非常に採用されたソリューションとそのコンポーネントに依存します。 自己治癒型COCホイルを再シールするには、保護された指を約1sの穴にそっと置き、穿刺を横切ってスライドさせます。高温と組み合わせてわずかな圧力は、大きすぎない穿刺の再シールを促進します。 リガンド浸漬注:余分な母酒は、リガンド浸漬前に除去することができる。この操作を行うには、4.1.1 から 4.1.3 に記載されている手順に従います。 反応管内の所望の濃度で母酒中のリガンドを溶解する。 不溶性粒子を除去するために、12,000 x gで溶液を10分間回転させます。必要に応じて、温度制御遠心分離機を使用します。 ボリュームをゆっくりと最大にします。3 μLのリガンド含有溶液を、長い押し出されたピペット先端を用いてCOC箔とポリイミド膜との隙間に含有する。先端を引き込みます。 自己修復COCホイルを再シールするには、保護された指を約1sの穴にそっと置き、穿刺を横切ってスライドさせます(4.1.5も参照)。 膜全体の拡散を可能にするために、しばらくの間実験をインキュベートします。浸漬時間は、拡散溶液およびその成分29の粘度に大きく依存する。 手順 4.2.1 から 4.2.5 を複数回繰り返し、その後異なるリガンドを浸します。 5. 周囲温度でのその現場回折データ収集 注: 溶媒の散乱を最小限に抑えるには、データ収集の前に余分な溶液を除去してください。 事前に確立された条件30と安定した湿度制御ビームライン環境を確保してください。 透明なCOC箔を鉗子を使って指定したポイントでゆっくりと持ち上げ、ヨーグルトカップから蓋を取り除くように剥がします(図6B)。 サンプルホルダーをキャビティからゆっくりと持ち上げ、すぐに予め用意された磁気サンプルホルダーベースに挿入します。この手順には接着剤は必要ありません (図6B)。 穏やかな圧力をかけて、ベース内のサンプルホルダーの正しい位置を確保します。 サンプルホルダーをビームラインゴニオメーターに取り付け、ホルダーの正しい位置を確認します。ゴニオメーターの形状に応じて、サンプルホルダーは回折実験中にシャドウを引き起こすことなく、最大160°回転させることができます。 ペーパーウィックを使用し、余分な母酒を除去するために裏側から黄色のポリイミド箔を穏やかに触れます。その段階では、リガンド浸漬またはクライオ保護も同様に行われる可能性があることに注意してください。これで、サンプルを中心に回回しデータを収集する準備ができました。 取り外し可能な外輪を持つサンプルホルダーを使用する場合は、外輪を保持して穏やかな圧力をかけ、指定されたブレークポイントでブレークオフします(図6C)。これで、サンプルを中心に回回しデータを収集する準備ができました。 6. 低温でのその現場回折データ収集 注: 手順 4.1.1 を実行して、サンプルから残留母酒を除去することをお勧めします。4.1.3 に。溶媒の散乱を最小限に抑えるために、次の手順を続行する前に。ほとんどのサンプルは、以前のクライオ保護31なしで液体窒素に移され得る。凍結保護が必要な場合は、手順 4.1.1 を参照してください。4.1.5 に。 鉗子を使用して指定されたポイントでCOC箔をゆっくりと持ち上げ、それを剥がします(ステップ5.1.2を参照)(図6A)。 サンプルホルダーをキャビティから取り外し、磁気サンプルホルダーベースに取り付けます。穏やかな圧力は、正しく、堅い継手を保障するために適用されてもよい(ステップ5.1.5、図6Bを参照)。注:対称的に配置された断裂点は、穏やかな圧力を加えることによってサンプルホルダーの外輪を簡単に取り外すことを可能にします(ステップ5.1.8.、図6Cを参照)。今、サンプルホルダーは準備ができて、液体窒素に突入することができます。サンプルホルダータイプ2および3(図1B、1C)の形状は、ロボット支援サンプル取り付けに使用できる標準的なSPINEサンプルバイアルへの転送を可能にします(図6D)。