Descubrimiento de producto natural con filtrado de fragmentación de diagnóstico LC-MS/MS: aplicación para análisis de Microcystin
Summary
El filtrado de fragmentación de diagnóstico, implementado en MZmine, es un enfoque elegante de postadquisición para la pantalla de datasets LC-MS/MS para clases enteras de productos naturales conocidos y desconocidos. Esta herramienta busca espectros MS/MS para los iones de producto y/o pérdidas neutrales que el analista ha definido como diagnóstico para toda la clase de compuestos.
Abstract
Los productos naturales son a menudo biosintetizados como mezclas de compuestos estructuralmente similares, en lugar de un solo compuesto. Debido a sus características estructurales comunes, muchos compuestos dentro de la misma clase se someten a una fragmentación MS/MS similar y tienen varios iones de producto idénticos y/o pérdidas neutrales. El propósito del filtrado de fragmentación de diagnóstico (DFF) es detectar eficientemente todos los compuestos de una clase dada en un extracto complejo mediante el cribado de datasets LC-MS/MS no dirigidos para espectros MS/MS que contengan iones de productos específicos de la clase y/o pérdidas neutrales. Este método se basa en un módulo DFF implementado dentro de la plataforma MZmine de código abierto que requiere que los extractos de muestra sean analizados mediante la adquisición dependiente de los datos en un espectrómetro de masas de alta resolución, como Orbitrap cuadrupolo o masa de tiempo de vuelo cuadrupolo Analizadores. La principal limitación de este enfoque es que el analista primero debe definir qué iones de producto y/o pérdidas neutrales son específicos para la clase específica de productos naturales. DFF permite el descubrimiento posterior de todos los productos naturales relacionados dentro de una muestra compleja, incluyendo nuevos compuestos. En este trabajo, demostramos la efectividad de la DFF mediante el cribado de extractos de Microcystis aeruginosa, una prominente floración de algas dañina que causa cianobacterias, para la producción de microcistina.
Introduction
LA espectrometría de masas en tándem (MS/MS) es un método de espectrometría de masas ampliamente utilizado que implica aislar un ion precursor e inducir la fragmentación mediante la aplicación de energía de activación como la disociación inducida por colisión (CID)1. La forma en que un fragmento de iones está íntimamente ligado a su estructura molecular. Los productos naturales son a menudo biosintetizados como mezclas de compuestos estructuralmente similares en lugar de como un único químico único2. Como tal, compuestos estructuralmente relacionados que son parte de la misma clase biosintética a menudo comparten características de fragmentación de MS/MS clave, incluyendo iones de productos compartidos y/o pérdidas neutrales. La capacidad de detectar muestras complejas para compuestos que poseen iones de productos específicos de la clase y/o pérdidas neutrales es una estrategia poderosa para la detección de clases enteras de compuestos, lo que podría llevar al descubrimiento de nuevos productos naturales3, 4 , 5 , 6. durante décadas, los métodos de espectrometría de masas como el escaneo de pérdida neutra y el escaneo de iones precursor realizado en instrumentos de baja resolución han permitido la detección de iones con la misma pérdida neutra o iones de producto. Sin embargo, los iones o transiciones específicos debían definirse antes de realizar los experimentos. Como los espectrómetros de masas de alta resolución se han vuelto más populares en los laboratorios de investigación, las muestras complejas ahora se examinan comúnmente utilizando métodos de adquisición dependientes de datos (DDA) no dirigidos. En contraste con la pérdida neutra tradicional y el escaneo de iones precursores, los compuestos estructuralmente relacionados pueden identificarse mediante el análisis posterior a la adquisición7. En este trabajo, demostramos una estrategia que hemos desarrollado denominado filtrado de fragmentación de diagnóstico (DFF)5,6, un enfoque sencillo y fácil de usar para detectar clases enteras de compuestos dentro de matrices complejas. Este módulo DFF se ha implementado en la plataforma de código abierto MZmine 2 y está disponible descargando MZmine 2,38 o versiones más recientes. DFF permite a los usuarios de pantalla eficientemente los datasets de DDA para espectros MS/MS que contienen iones del producto y/o pérdidas neutrales que son diagnósticos para clases enteras de compuestos. Una limitación de DFF son los iones de producto característicos y/o las pérdidas neutrales para una clase de compuestos deben ser definidos por el analista.
Por ejemplo, cada una de las más de 60 micotoxinas fumonisina diferentes identificadas como8,9 poseen una cadena lateral tricarballylic, que genera un ion m/z 157,0142 (C6H5O5-) deproducto al fragmentación de la [M-H]– ion4. Por lo tanto, todas las fumonisinas putativas en una muestra pueden detectarse utilizando DFF mediante la detección de todos los espectros MS/MS dentro de un DataSet de DDA que contienen el ion de producto m/z 157,0142 prominente. Del mismo modo, los compuestos sulfados pueden detectarse mediante la detección de datasets DDA para espectros MS/MS que contengan una pérdida diagnóstica neutra de 79,9574 da (SO3)3. Este enfoque también se ha aplicado con éxito para la detección de nuevos péptidos cíclicos5 y productos naturales que contienen residuos de triptófano o fenilalanina6.
Para demostrar la efectividad de dff y su facilidad de uso dentro de la plataforma mzmine10, hemos aplicado este enfoque al análisis de microcistinas (MCS); una clase de más de 240 toxinas relacionadas estructuralmente producidas por las cianobacterias de agua dulce11,12,13.
Las cicotoxinas más comúnmente reportadas son MCS, con el congénere MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) más frecuentemente estudiado (figura 1). Los MCs son heptapéptidos monocíclicos no ribosómicos, biosintetizados por múltiples géneros de cianobacterias incluyendo Microcystis, Anabaena, Nostoc, y Planktothrix12,13. Los MCs se componen de cinco residuos comunes y dos posiciones variables ocupadas por los aminoácidos L. Casi todos los MCs poseen un residuo característico de β-Amino ácido 3-amino-9-metoxi-2, 6, 8-trimetil-10-fenildeca-4, 6-ácido dienoico (ADDA) en la posición 511. Las vías de fragmentación de MS/MS de MCS se describen bien14,15; el residuo de ADDA es responsable del producto prominente de MS/MS, m/z 135,0803+ (c9h11O+), así como otros iones de producto incluyendo m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (figura 2). Los datasets de DDA no dirigidos de extractos celulares de Microcystis aeruginosa pueden ser examinados para todas las microcistinas presentes utilizando estos iones diagnósticos, ya que las microcistinas tienen un residuo de ADDA.
Protocol
Representative Results
Discussion
La DFF es una estrategia rápida y directa para detectar clases enteras de compuestos, especialmente relevantes para el descubrimiento compuesto de productos naturales. El aspecto más importante de DFF es definir los criterios específicos de fragmentación de MS/MS para la clase de compuestos específica. En este ejemplo representativo, DFF se usó para detectar todos los residuos de Adda que contienen MCs presentes en un extracto celular de M. aeruginosa . Aunque la gran mayoría de los MCs contienen un resid…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Heather Roshon (centro de cultura phycological canadiense, Universidad de Waterloo por proporcionar la cultura de las cianobacterias estudiadas y Sawsan Abusharkh (Universidad de Carleton) para la asistencia técnica.
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Altro | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
Riferimenti
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
- Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
- Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
- Bartók, T., Szécsi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterházy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
- Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
- Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
- Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
- Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
- Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
- Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
- Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
- Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).
