Gravação ótica do único-fóton do largo-campo em fatias do cérebro usando a tintura tensão-sensível

A imagem latente da tintura tensão-sensível do fóton do largo-campo único (vsd) de preparações Bulk-manchadas da fatia do cérebro transformou-se uma ferramenta quantitativa útil para avaliar a dinâmica de circuitos neurais^1,2,3,4 . Após a análise das alterações nas propriedades ópticas devido à excitação de membrana^5,6,7, a imagem de VSD foi descrita pela primeira vez no início da década de 1970 por Cohen e outros^{6,7, 9}.; é um método adequado para monitorar as funções cerebrais em tempo real, como o corante diretamente sonda as mudanças de potencial de membrana (ou seja, o sinal primário dos neurônios).

Os VSDs os mais adiantados possuíram as características desejáveis para compreender o sistema do cérebro, tal como um tempo-constante rápido para seguir a cinética rápida de eventos potenciais da membrana neuronal, e a linearidade com a mudança no potencial de membrana^{9, 10} de ^{, 11} anos de ^{, 12 anos} de ^{, 13} anos de ^{, 14} anos de ^{, 15}. similar a outras experiências da imagem latente, esta técnica exige uma escala larga de afinações específicas, tais como as câmeras, o sistema ótico, o software, e a fisiologia da fatia, para realizar os resultados desejados. Devido a estas armadilhas técnicas, os benefícios esperados durante os esforços iniciais não se materializam necessariamente para a maioria dos laboratórios que não se especializou nesta técnica.

A causa primordial da dificuldade técnica era a baixa sensibilidade do VSD para a mudança potencial da membrana quando aplicada à mancha maioria de preparações da fatia. A magnitude do sinal óptico (ou seja, a alteração fracionária na fluorescência) é geralmente 10^-4-10^-3 do sinal de controle (F0) condições fisiológicas. A escala de tempo da mudança potencial da membrana em um neurônio é aproximadamente milissegundos a poucas centenas de milissegundos. Para medir as alterações no potencial de membrana do Neuron, a câmera que está sendo usada para a gravação deve ser capaz de adquirir imagens com alta velocidade (10 kHz a 100 Hz). A baixa sensibilidade do VSD e a velocidade necessária para seguir o sinal neural requer uma grande quantidade de luz a ser coletada na câmera em alta velocidade, com uma alta relação sinal-ruído (S/N)^2,16.

A ótica do sistema de gravação também é um elemento crítico para garantir a coleta de luz suficiente e para melhorar S/N. A ampliação alcançada pela ótica é muitas vezes excessivamente baixa, como 1X a 10X, para visualizar um circuito neural funcional local. Por exemplo, para visualizar a dinâmica do circuito hipocampal, uma ampliação de aproximadamente 5 seria adequada. Essa baixa ampliação tem baixa eficiência de fluorescência; Conseqüentemente, o sistema ótico avançado seria benéfico para tal gravação.

Além disso, a fisiologia da fatia também é essencial. Uma vez que a análise de imagem requer que as fatias sejam intactas, é necessária uma manipulação cuidadosa da fatia¹⁷. Além disso, as medidas tomadas para manter a viabilidade da fatia por um tempo mais longo são importantes¹⁸.

O presente artigo descreve o protocolo para preparação de fatias, coloração de VSD e medições. O artigo também descreve as melhorias para o VSDs, dispositivo de imagem e óptica, e outros refinamentos adicionais para o sistema experimental que permitiram que este método para ser usado como um ensaio simples, poderoso e quantitativo para visualizar o modificação das funções cerebrais^{19,20,21,22,23,24,25}. A técnica pode igualmente ser amplamente utilizada para a potenciação a longo prazo na área CA1 de fatias hippocampal¹. Além disso, esta técnica também é útil na gravação óptica de potenciais de membrana em uma única célula nervosa²⁶.