Consegna di anticorpi nel cervello di Murine tramite consegna convezione-migliorato
Summary
La consegna a convezione migliorata (CED) è un metodo che consente la consegna efficace delle terapie nel cervello mediante la perfusione diretta di grandi volumi di tessuto. La procedura richiede l’uso di cateteri e una procedura di iniezione ottimizzata. Questo protocollo descrive una metodologia per il CED di un anticorpo in un cervello di topo.
Abstract
La consegna a convezione (CED) è una tecnica neurochirurgica che consente una perfusione efficace di grandi volumi cerebrali utilizzando un sistema di catetere. Tale approccio fornisce un metodo di somministrazione sicuro superando la barriera ematoencefalica (BBB), consentendo così il trattamento con terapie con scarsa permeabilità BBB o quelli per i quali l’esposizione sistemica non è desiderata, ad esempio a causa della tossicità. CED richiede l’ottimizzazione del design del catetere, del protocollo di iniezione e delle proprietà dell’infusate. Con questo protocollo viene descritto come eseguire il CED di una soluzione contenente fino a 20 g di anticorpo nel putamen caudato dei topi. Descrive la preparazione dei cateteri a gradini, testandoli in vitro ed eseguendo il CED nei topi utilizzando un programma di iniezione rampante. Il protocollo può essere facilmente regolato per altri volumi di infusione e può essere utilizzato per iniettare vari tracciatori o sostanze farmacologicamente attive o inattive, tra cui chemioterapiche, citochine, particelle virali e liposomi.
Introduction
La barriera ematoencefalica (BBB) forma un confine semipermeabile che separa il sistema nervoso centrale (SNC) dalla circolazione sanguigna. Raggiungere il CNS con terapie è tuttavia necessario nel contesto di varie malattie, come tumori cerebrali, Morbo di Alzheimer (AD) o morbo di Parkinson (PD) tra gli altri1. Questo diventa importante nello sviluppo di nuove terapie, soprattutto se il farmaco testato presenta scarsa permeabilità BBB o la sua esposizione sistemica può portare a tossicità pericolosa1,2. Alcuni degli anticorpi clinicamente utilizzati mostrano entrambe queste caratteristiche. Una soluzione a questo problema sarebbe quella di fornire le terapie direttamente dietro la BBB.
La consegna convezione-migliorato (CED) è una tecnica neurochirurgica che consente una perfusione efficace di grandi volumi cerebrali. Ciò si ottiene installando chirurgicamente uno o più cateteri nell’area di destinazione. Durante l’applicazione del farmaco, si forma un gradiente di pressione all’apertura del catetere, che diventa la forza motrice della dispersione infusate nel tessuto3,4. È quindi la durata dell’infusione e non i coefficienti di diffusione che determinano l’intervallo di perfusione2,4,5. Questo fornisce una consegna uniforme dell’infusate su un volume cerebrale molto più grande rispetto ai metodi convenzionali di iniezione intracerebrale basati sulla diffusione2,6. Allo stesso tempo, questa modalità di consegna ha un minor rischio di danni ai tessuti2. Di conseguenza, il CED può consentire una somministrazione sicura ed efficace della chemioterapeutica convenzionale per il trattamento dei tumori del SNC, nonché la somministrazione di agenti immunomodulatori o anticorpi agonistici e antagonisti in una moltitudine di altri disturbi del SNC2 ,7,8,9. CED è attualmente testato in terapie del morbo di Parkinson, Morbo di Alzheimer, così come glioma di alta qualità2,7,8,10,11.
Il design del catetere e il regime di iniezione sono tra i fattori più importanti che influenzano l’esito del CED 10,12,13,14,15,16. Inoltre, richiede specifiche proprietà fisiche dell’infusate, comprese le dimensioni moderate delle particelle, una carica anionica e una bassa affinità tissutale 10,17. Ognuno di questi parametri deve essere potenzialmente regolato in base alle caratteristiche istologiche della regione del cervello da mirare2,10,17.
Qui descriviamo la metodologia per l’esecuzione del CED di una soluzione anticorpale nel putamen caudato (striato) dei topi. Inoltre, il protocollo include la preparazione di cateteri a gradini in una configurazione di laboratorio, testandoli in vitro ed eseguendo il CED.
Ci sono più disegni di catetere disponibili nella letteratura, che differiscono per la forma della cannula, i materiali utilizzati e il numero di aperture catetere12,15,18,19,20 ,21,22. Stiamo usando un catetere a gradini fatto di un capillare di silice fuso sporgente 1 mm da un ago metallico finale smussato. Questo design catetere può essere facilmente prodotto in un laboratorio di ricerca e fornisce risultati cED riproducibili quando testato in vitro con blocchi di agarose con parametri fisici simili al parenchyma cerebrale in vivo23.
Inoltre, implementiamo un regime di rampa per la consegna di 5 LeL di infusate in vivo. In un protocollo di questo tipo il tasso di iniezione è aumentato da 0,2 a 0,8 l/min, riducendo così al minimo le probabilità di reflusso lungo il catetere e il rischio di danni ai tessuti16. Utilizzando questo protocollo, abbiamo somministrato con successo topi con fino a 20 g di anticorpi in 5 gradi l di PBS nel corso di 11 min 30 s.
Il protocollo può essere facilmente regolato per altri volumi di infusione o per iniettare varie altre sostanze, ad esempio chemioterapiche, citochine, particelle virali o liposomi2,10,14,18 ,22. In caso di utilizzo di infusate con proprietà fisiologiche drasticamente diverse rispetto a una soluzione salina tamponata da fosfato (PBS) o fluido cerebrospinale artificiale (aCSF) di anticorpi, si raccomandano ulteriori misure di convalida. Per l’assemblaggio del catetere, la convalida e il CED, descriviamo tutti i passaggi utilizzando un robot stereotassico con un’unità di perforazione e iniezione montata su un normale telaio stereotassico. Questa procedura può essere eseguita anche con un telaio stereotassico manuale collegato alla pompa a microinfusione programmabile che può guidare i microsiringi di vetro descritti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La consegna migliorata della convezione, o infusione di farmaci mediati dalla pressione nel cervello, è stata proposta per la prima volta all’inizio del 19903. Questo approccio promette la perfusione di grandi volumi cerebrali dietro la barriera ematoencefalica in modo controllato2. Tuttavia, finora, solo pochi studi clinici sono stati eseguiti utilizzando questo approccio, in parte perché cED in una configurazione clinica ha dimostrato di essere tecnicamente esigente<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell’Università di zurigo (FK-15-057), della Novartis Foundation for medical-biological Research (16C231) e della Swiss Cancer Research (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) a Johannes vom Berg e BRIDGE Proof of Concept (20B1-1 _177300) a Linda Schellhammer.
Materials
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
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