식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용
Summary
여기에서, 우리는 세포와 조직에 나노 및 마이크로 들여 쓰기 공구로 작동하는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 제시합니다. 이 계측기는 시료의 3D 표면 지형과 세포벽 Young의 계수및 터거 압력을 포함한 기계적 특성을 동시에 수집할 수 있습니다.
Abstract
우리는 여기에 식물 조직을 들여 쓰기 위해 원자력 현미경 검사법의 사용을 제시하고 기계적 특성을 회복합니다. 들여쓰기 모드에서 두 개의 서로 다른 현미경을 사용하여 탄성 계수체를 측정하고 이를 사용하여 세포벽 기계적 특성을 평가하는 방법을 보여줍니다. 또한 turgor 압력을 평가하는 방법도 설명합니다. 원자력 현미경 검사법의 주요 장점은 비 침습적이고 상대적으로 빠르며 (5 ~ 20 분), 피상적으로 평평한 거의 모든 유형의 살아있는 식물 조직이 치료없이 분석 될 수 있다는 것입니다. 팁 크기와 단위 면적당 측정 횟수에 따라 해상도가 매우 좋을 수 있습니다. 이 방법의 한 가지 제한은 표면 세포 층에 직접 액세스 할 수 있다는 것입니다.
Introduction
원자력 현미경 검사법 (AFM)은 일반적으로 몇 나노미터의 반경을 가진 끝이 견본의 표면을 검사하는 스캐닝 프로브 현미경 검사법 (SPM) 가족에 속합니다. 표면의 검출은 광학 또는 전자 기반 방법을 통해 달성되지 않고 팁과 샘플 표면 사이의 상호 작용 힘을 통해 달성됩니다. 따라서, 이 기술은 샘플 표면의 지형 특성화(몇 나노미터까지 내려갈 수 있는 3D 분해능)에 국한되지 않고 정전기, 반데르발스 또는 접촉력과 같은 모든 유형의 상호 작용 력을 측정할 수 있다. 또한, 팁은 생물학적 샘플의 표면에 힘을 가하고 기계적 특성 (예를 들어, 영의 계수, 점탄성 특성)을 결정하기 위해 생성 된 변형, 소위 “들여 쓰기”를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
식물 세포벽의 기계적 성질은 발달 과정 1,2,3의기본 메커니즘을 이해하려고 할 때 고려해야 할 필수적입니다. 실제로, 이러한 특성은 세포가 성장할 수 있도록 세포벽 연화가 필요하기 때문에 특히 발달 중에 엄격하게 조절된다. AFM은 이러한 특성을 측정하고 장기, 조직 또는 발달 단계 간에 변화하는 방식을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
이 백서에서는 AFM을 사용하여 세포벽 기계적 특성과 터거 압력을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 2개의 응용은 2개의 다른 AFM 현미경에 설명되고 후에 여기에서 상세합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
식물의 모양의 출현은 주로 시간과 공간 동안 성장의 조정 속도와 방향에 의해 결정된다. 식물 세포는 다사카리딕 매트릭스로 만들어진 단단한 세포벽에 싸여 있으며, 이 세포는 이를 함께 붙입니다. 그 결과, 세포 확장은 세포벽에 당기는 터거 압력과 이 압력에 저항하는 세포벽의 강성 사이의 평형에 의해 제어된다. 근본적인 발달메커니즘을 이해하기 위해서는 주어진 장기의 다른 조직 또는 세…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PLATIM 팀의 기술 지원에 감사드리며, 아레즈키 부다우드와 RDP 연구소의 생물물리학 팀원들에게 도움이 되는 토론에 감사드립니다.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
Riferimenti
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants?. Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. Chapter 11 – In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
