스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착
Summary
스모는 필수적이 고 고도로 보존 된, 작은 유비퀴틴 같은 수정자 단백질입니다. 이 프로토콜에서 우리는 스트레스를 견딜 수 있는 재조합 스모-포착 단백질 (kmUTAG)의 사용을 설명 하 여 다양 한 세포 유형에 서 고유 하 고 태그가 지정 되지 않은 스모 결합체와 그 현지화를 시각화 합니다.
Abstract
여기에서 우리는 포유류 세포 및 네 마 테 ode 난 모에 있어서의 단백질의 수 모 화 및 그들의 하위 세포 국 소화를 연구 하는 신규 한 방법을 제시 하 고 있다. 이 방법은 변형 된 스모-포착 단백질 단편, kmUTAG, Ulp1 스모 프로 테아 제 로부터 유래 된, 스트레스 내성 신진 효 모 클 루 근 균을 활용 한다. 우리는 항 체를 사용 하지 않고 다양 한 모델 시스템에서 수 모 닐 화를 연구 하기 위한 목적으로 kmUTAG의 특성을 적용 했습니다. 스모의 연구에 대 한, KmUTAG 항 체 기반 접근 방식에 비해 몇 가지 이점이 있다. 이 스트레스에 강한 스모-포착 시 약은 재조합 적으로 생산 되며, 많은 종에서 자생 하는 스모이 소 양식을 인식 하 고, 시판 되는 항 체와는 달리 무료, 비 접합 스모에 대 한 친화도를 감소 보여줍니다. 여기에 표시 된 대표적인 결과는 포유류 조직 배양 세포 및 네 마 테 오드 모 난 모에 있어서의 스모 컨 쥬 게이트의 국 소화를 포함 한다.
Introduction
이 방법의 목적은 재조합 스모-포착 UTAG (ULp 도메인 태그) 단백질을 사용 하 여 스모 컨 쥬 게이 터 단백질의 연구 및 분석을 용이 하 게 하기 위한 것 이다. 아래에 설명 된 바와 같이, UTAG는 스모 변성 단백질을 정화, 검출 및 시각화 하기 위한 다른 시 약과 접근법을 대신 하 여 사용할 수 있습니다. 성장 조건에 따라 세포는 스모 또는 스모 사슬로 수정 된 수백 또는 수천 개의 단백질을 함유 할 수 있습니다 (검토를 위해 커 셔 외 20061 과 케르 셔 20162). 이것은 특정 스모 변성 단백질의 기능적 분석에 대 한 상당한 어려움을 나타내며, 특히 특정 수 모 닐 화 대상의 분 획만이 실제로3개 수정 되기 때문 이다. 전사 조절, 단백질 항상성, 세포 스트레스에 대 한 반응, 유사 분열 증 및 감수 분열 시 염색 질 리 모델링이 같은 필수적인 세포 과정에서의 역할에 더하여; 이제는 스모, 스모 변성 단백질, 스모 통로 성분이 암 및 퇴행 성 신경 장애 등의 병리학에 대 한 바이오 마커로 서 잠재력을가지고 있다는 것이 충분히 명백 해지고 있다4,5,6 ,7. 이는 다양 한 세포 및 샘플에서 스모 변성 단백질의 검출 및 기능적 분석을 위한 견고 하 고 안정적 이며 쉽게 사용할 수 있는 도구와 혁신적인 접근법의 필요성을 강조 합니다.
많은 시스템에서, 스모 특이 적 항 체는 스모 변성 단백질의 검출, 분리 및 기능적 분석을 위한 선택의 시 약 이다8,9. 그러나, 일부 상업적으로 입수 가능한 스모 특이 적 항 체는 비싸고, 수량 또는 가용성이 제한적 이며, 격렬 한 가변 친화도 및 교차 반응성을 나타내는 경향이 있으며, 일부 경우에는 재현성10이 결여 된다. 하나의 대안적 접근법은 형질 전환 된 세포 및 유기 체에서에 피토 프 태그 스모의 발현 이지만, 스모에 피토 프 태그를 연결 하는 것은 인위적으로 단백질 표적11에 대 한 그의 컨 쥬 게이 션을 낮출 수 있다. 추가적으로,에 피토 프는 형질 전환 되지 않은 세포 또는 조직이 평가 될 때 유용 하지 않다.
Ulp1는 스모 접합 단백질12를 모두 처리 하 고 모 전 구체를 공정 하 게 하는 s. 세레 비시 로부터 보존 된 스모 프로 테아 제 이다. 뜻밖 관찰에 기초한 UTAG 시 약을 개발 하 여 Ulp1’s 스모 가공에 있어서의 촉매 시스테인 (C580S)의 돌연변이가 스모의 분열을 예방할 뿐만 아니라, 스모 접합 단백질을 높은 것으로 함정에도 조류 패12. 편의상이 카 르 복 시-말단 스모-트래핑 Ulp1 (C580S) 단편을 UTAG (UD 태그에 대 한 짧은) 라고 합니다. UTAG는 스모 변성 단백질의 분리 및 검출에 사용 되는 항 스모 항 체에 대 한 유용한 대안을 나타내는 재조합 범 스모 포획 단백질 이다. 특히 스모에는 하나 또는 여러 개의에 피토 프만이 아니라, 기본적으로 접힌, 공액 스모를 인식 하는 것이 중요 합니다. UTAG의 단백질 안정성과 스모 결합 강도를 모두 개선 하기 위해, 스트레스에 강한 효 모 근 종 균 (Km)에서 utag의 변형을 생성 했습니다. KmUTAG는 스모 컨 쥬 게이트를 나노 몰 친화도13으로 단단히 묶습니다. 또한, kmUTAG는 높은 온도 (42 ° c), 환 원제 (5mm carboxyethyl) 포스 핀 히드로 클로 라 이드 (변성 제), 산화 제 (0.6% 과산화 수소) 및 비 이온 성 세제에 내성이 있습니다. 이 응력 허용 오차는 가혹한 정화 조건 및 장기간의 인큐베이션 시간 동안에 유익 하 여 안정성과 스모 포착 활동을 보장 합니다. 그러나 놀랍게도 KmUTAG의 스모 포획 활동은 시스테인 변성 시 약, 이온 성 세제 및 완전히 변성 된 단백질 추출 물과 호환 되지 않습니다. KmUTAG의 현저한 친화도 및 특성은이 시 약이 여러 종의 수 모 화 단백질의 연구를 위한 표준 레 퍼 토리의 일부가 될 수 있음을 나타낸다.
여기에서 우리는 재조합 형광 mCherry-KmUTAG 융합 단백질 (kmUTAG fl)을 이용 하 여 포유류 세포 및 선 충에서 스모 변성 단백질을 검출 하는 간단한 방법을 제공 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 고정 포유류 세포에서 스모의 기능적 연구를 위한 재조합 단백질 인 kmutag-fl의 사용을 소개 하 고, 선 충 생식 기를 해 부 한다. KmUTAG-fl은 기본 스모 컨 쥬 게이 터 단백질과 스모 체인을 인식 하 고 트래핑 하는 스트레스를 견 디는 팬 스모 특정 시 약입니다. 스모의 3 차 구조는 고도로 보존 되어 있기 때문에 추가 모델과 비 모델 시스템에서 스모 변형이 kmUTAG-fl 시 약으로 분석 될 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 지원을 위해 Kerscher 연구소의 모든 구성원에 게 감사 하 고 싶습니다, 원고의 중요 한 독서에 대 한 나탈리 응 우 옌, 시퀀싱 Lidia Epp. 이 작품은 연방 연구 상용화 기금 MF16-LS에 의해 확인에 의해 지원 되었다. W & M 학생 들에 대 한 연구 지원은 베일리-휴스턴 연구 기금에 의해 제공 되었으며 찰스 센터는 리와 CH에 대 한 펠로 우 십을 존중 합니다.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
Riferimenti
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