Extracción de metabolitos acuosos de células adherentes cultivadas para análisis metabolómicos por electroforesis capilar-espectrometría de masas

1. cultivo celular el día 1 Nota: cada muestra para la extracción de metabolitos debe prepararse a partir de un único plato de cultivo de tejido de 100 mm que sea moderadamente pero no completamente confluido (que contiene aproximadamente 2 – 5 millones de células). Calcular el número de platos necesarios para el ensayo y prepararlos en consecuencia. Cultivo HCC827 y células PC-9 en 5% CO2 a 37 ° c en rpmi-1640 medio complementado con 10% suero bovino fetal (FBS). Aspiran los medios de cultivo celular de los platos de cultivo de 100 mm. Lave las células de cada plato con 2 mL de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesio. Rocía suavemente cada plato para que la solución PBS cubra completamente la superficie del plato. Aspiran el tampón de lavado de los platos de cultivo. Calentar un 0,25% de solución de tripsina-EDTA a 37 ° c y añadir 2 mL de solución de tripsina-EDTA con una picada serológica de 5 mL. Rocía suavemente cada plato para que la tripsina cubra completamente la superficie del plato. Incubar los platos de cultivo a 37 ° c durante aproximadamente 5 min. Añadir 4 mL de medio de crecimiento completo pre-calentado por plato. Resuspenda las células en medio, pipeteando suavemente varias veces. Transfiera cada suspensión celular a un tubo cónico separado de 15 mL y centrifugue a 800 × g durante 5 min. Resuspend cada pellet de células en 2 mL de medio de crecimiento completo pre-calentado. Determinar el número total y la viabilidad porcentual de las células utilizando el contador de células automatizado y 0,4% solución azul tripan. Mezclar 10 μL de suspensión celular y 10 μL de solución 0,4% azul tripan. Cargue 10 μL de muestra en la cámara de recuento de células deslizando la acción capilar. Inserte el deslizamiento de la cámara en el contador de celdas automatizado. La luz transmitida se ilumina automáticamente y el instrumento automático se enfoca en la célula. Pulse el botón Capture para capturar la imagen y visualizar los resultados. Si es necesario, agregue un medio de crecimiento adicional para obtener la concentración de células deseada. Siembra aproximadamente 1 – 2,5 millones de células por plato de cultivo celular de 100 mm.Nota: las concentraciones de metabolito determinadas por el análisis CE-MS se normalizarán en función del número de células viables. A los efectos del conteo de células, es necesario preparar al menos un plato de cultivo adicional para cada grupo. Incubar los platos de cultivo en 5% CO2 a 37 ° c durante 18 h. 2. preparación de los reactivos Diluir una solución estándar interna comercial incluyendo L-metionina sulfona y d-Camphor-10-sulfonic acid 1000-fold en agua ultrapura.Nota: para menos de 80 muestras, basta con mezclar 50 μL de la solución estándar interna 1 y 45 mL de agua ultrapura en un matraz aforado de 50 mL y, a continuación, llevar la solución hasta 50 mL con agua ultrapura. Prepare una solución de manitol 0,05 g/mL en agua ultrapura como tampón de lavado.Nota: para menos de 30 muestras, simplemente disuelva 25 g de manitol en 500 mL de agua ultrapura. Se requieren aproximadamente 15 mL de tampón de lavado por plato de cultivo de 100 mm, así que prepare un volumen suficiente de tampón de lavado según el número de muestras. 3. pre-lavado de las unidades de filtro centrífugo Pipetear 250 μL de agua ultrapura en el vaso filtrante de cada unidad filtrante centrífuga (ver tabla de materiales).Nota: se requieren dos unidades de filtro por muestra. Tapar las unidades de filtro firmemente y centrifugar a 9.100 × g a 4 ° c durante 5 min. Compruebe el volumen de cada filtrado — si se ha acumulado un filtrado significativo durante el primer centrifugado corto, la unidad filtrante puede estar defectuosa. En este caso, deseche la unidad de filtro y utilice en su lugar una nueva unidad de filtro. Cierre las tapas de las unidades de filtro firmemente y centrifugue de nuevo a 9.100 × g a 4 ° c durante 30 min. Asegúrese de que no quede agua ultrapura en ninguna de las tazas de filtro; retirar el agua ultrapura filtrada en cada tubo de recogida con una picada y desechar.Nota: no intente retirar el agua residual de un vaso filtrante con una pileta, ya que puede dañar el filtro. Reemplace las tazas de filtro en sus tubos de recolección.Nota: Utilice las unidades filtrantes centrífugas en el plazo de una hora ya que los filtros pueden dañarse tras el secado. 4. cultivo celular el día 2 Sacar los platos de cultivo de 100 mm de la incubadora.Nota: la duración recomendada del cultivo celular es de 18 h. Aspiran el medio de cultivo celular de cada plato de cultivo de 100 mm. Añadir 10 mL de medio de cultivo celular que incluya las concentraciones apropiadas de compuestos o fármacos a cada plato, teniendo cuidado de no perturbar la capa celular.Nota: para fines demostrativos, añadimos 10 μL de diamida de 250 mM disuelto en PBS (concentración final de 250 μM) en este experimento. Incubar los platos de cultivo a 37 ° c durante 30 min en presencia de diamida o PBS como control. Aspiran el medio de cultivo celular de cada plato de cultivo de 100 mm. Lave las células añadiendo suavemente 2 mL de solución de manitol al borde de cada plato con un 5%, cuidando de no perturbar la capa celular, luego Incline levemente el plato.Nota: PBS o solución salina interfiere con el análisis metabolómico basado en CE-MS y afecta negativamente a los resultados de la medición, y por lo tanto no debe ser utilizado como tampón de lavado. Aspire el tampón de lavado de cada plato de cultivo, luego lave las células de nuevo añadiendo suavemente 10 mL de tampón de lavado por plato y inclinando ligeramente el plato. Aspire por completo el tampón de lavado desde el borde de cada plato de cultivo.Nota: aspiran tanto como sea posible el tampón de lavado, prestando atención a no aspirar las células. Manitol residual puede interferir con el análisis CE-MS; aspiración de las células disminuirá el número de celdas y así convertirse en una fuente de error en la normalización de datos. 5. extracción de metabolitos de células cultivadas Añadir 800 μL de 99,7% de metanol por plato de cultivo. Rocía suavemente cada plato de cultivo de ida y vuelta para cubrir toda su superficie. Dejar los platos a temperatura ambiente durante 30 s. Añada lentamente 550 μL de la solución estándar interna diluida por plato sumertiendo la punta de la picada en el metanol y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Rocía suavemente cada plato de cultivo de ida y vuelta para cubrir toda su superficie. Dejar los platos a temperatura ambiente durante 30 s. 6. ultrafiltración de extractos celulares Transfiera la solución extraída de cada plato de cultivo a un tubo de microcentrífuga 1,5 mL separado. Centrifugar los tubos a 2.300 × g a 4 ° c durante 5 min. Transfiera 350 μL de cada sobrenadante en dos unidades filtrantes centrífugas por muestra.Nota: de cada plato de cultivo, se transfiere un total de 700 μL de la solución extraída a dos tubos filtrantes (350 μL/tubo). Centrifugar los tubos filtrantes a 9.100 × g a 4 ° c durante aproximadamente 2 h hasta que no quede líquido en las copas del filtro. Retire las copas del filtro y cierre bien las tapas de los tubos de recogida. 7. muestra la evaporación Prepare un evaporador centrífugo — típicamente, esto consiste en un evaporador, una trampa fría, y una bomba de vacío. Coloque los tubos de recolección en el evaporador centrífugo.Nota: deje las tapas de los tubos abiertas. Evaporar las soluciones de muestra extraídas en condiciones de vacío a temperatura ambiente.Nota: las configuraciones típicas para el número de rotaciones y la presión son 1.500 rpm y 1.000 PA, respectivamente, y por lo general toma aproximadamente 3 h para evaporar completamente las muestras. Confirme que no quede líquido en ninguno de los tubos de recogida y cierre las tapas de los tubos firmemente. Almacene los tubos de recolección en un congelador profundo de temperatura ultrabaja (− 80 ° c) hasta el análisis metabolómicos. 8. análisis metabolómico por CE-MS Resuspend el filtrado en 50 μL de agua ultrapura inmediatamente antes del análisis CE-MS. Realizar análisis CE-MS por métodos descritos anteriormente12,13 utilizando sistema de electroforesis capilar y el sistema de espectrómetro de masa de tiempo de vuelo equipado con una bomba isocrática, un adaptador de CE-MS, y un pulverizador CE-ESI-ms.Nota: ambos sistemas pueden ser controlados por el software de los vendedores del sistema y están conectados por un capilar de sílice fundido (50 μm de diámetro interno × 80 cm de longitud total). Configure instrumentos y viales de muestra, prepare el capilar con un cassette capilar, reponga los líquidos de la vaina y los búferes de electroforesis apropiados dependiendo del modo de análisis de aniones o cationes, y luego aplique tensiones.Nota: las condiciones analíticas y de instrumentación se describen detalladamente en otros12,13. Abra el software y prepare un pool de trabajo que contenga métodos de adquisición de datos e información de muestra. Iniciar una ejecución de prueba y comprobar los datos como la intensidad de la señal y la forma de pico de los estándares internos y la resolución de picos de otros compuestos estándar. Ajuste las condiciones analíticas si es necesario. Inyectar las soluciones de muestra a 50 mbar durante 3 s y una tensión de 30 kV.Nota: CE-MS se llevó a cabo ya sea en el modo de iones positivo o negativo. Fije el espectrómetro para escanear el rango de masa m/z 50 – 1000. La tensión capilar se estableció en 4 kV; el caudal de gas nitrógeno (temperatura del calentador 300 ° c). Para el modo positivo, el fragmentor, el skimmer y el voltaje OCT RFV se configuraron en 75, 50 y 125 V, respectivamente. Para el modo de iones negativos, el fragmentor, el skimmer y el voltaje OCT RFV se configuraron en 100, 50 y 200 V, respectivamente. Analice los datos del espectro. Extraiga los picos de los datos espectrales de masas utilizando el software de integración automática para obtener información de picos incluyendo m/z, área de pico y tiempo de migración (MT).Nota: el método se describe detalladamente en otro lugar14. Excluir picos de señal correspondientes a isotopomers, iones aductos y otros iones de producto de metabolitos conocidos. Anote los picos restantes con información de la base de datos del metabolito HMT según los valores m/z y mts. Normalizar las áreas de los picos anotados a niveles estándar internos y números de celdas por muestra. Evaluar la concentración de cada metabolito en las células cultivadas (pmol/106 células) utilizando curvas estándar preparadas para cada metabolito. Utilice las concentraciones de metabolito cuantificados para análisis estadísticos posteriores e interpretaciones biológicas14.