Extração de metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise Metabolomica por espectrometria de massa eletroforese capilar

1. cultura de células no dia 1 Nota: cada amostra para extração de metabolito deve ser preparada a partir de um único prato de cultura de tecido de 100 mm que é moderadamente mas não totalmente confluente (contendo aproximadamente 2 – 5 milhões de células). Calcule o número de pratos necessários para o ensaio e prepare-os em conformidade. Cultura HCC827 e células PC-9 em 5% CO2 a 37 ° c em RPMI-1640 médio suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS). Aspirar a mídia de cultura celular dos pratos de cultura de 100 mm. Lave as células em cada prato usando 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio. Balanç delicadamente cada prato de modo que a solução de PBS cubra completamente a superfície do prato. Aspirar o tampão de lavagem dos pratos de cultura. Solução morna do trypsin-EDTA de 0,25% a 37 ° c e adicione 2 ml da solução do trypsin-EDTA com uma pipeta sorológicos de 5 ml. Delicadamente rocha cada prato de modo que o tripsina cubra completamente a superfície do prato. Incubar os pratos de cultura a 37 ° c por aproximadamente 5 min. Adicione 4 mL de meio de crescimento completo pré-aquecido por prato. Ressuscitar as células em meio por pipetagem suavemente várias vezes. Transfira cada suspensão de células para um tubo cônico separado de 15 mL e centrifugue a 800 × g durante 5 min. Resuspend cada pelota da pilha em 2 mL do meio de crescimento completo pre-aquecido. Determine o número total e a viabilidade percentual das células usando o contador de células automatizado e a solução 0,4% azul de Tripan. Misture 10 μL de suspensão celular e 10 μL de solução de 0,4% de azul de Tripan. Carregue 10 μL de amostra na corrediça da câmara de contagem de células através da ação capilar. Insira o slide da câmara no contador de células automatizado. A luz transmitida ilumina automaticamente e o auto do instrumento centra-se sobre a pilha. Pressione o botão Capture para capturar a imagem e exibir os resultados. Se necessário, adicione um meio de crescimento adicional para obter a concentração de células desejada. Semente aproximadamente 1 – 2.5 milhão pilhas por o prato da cultura da pilha de 100 milímetros.Nota: as concentrações de metabolito determinadas pela análise CE-MS serão normalizadas com base no número de células viáveis. Para a finalidade da contagem da pilha, é necessário preparar pelo menos um prato de cultura semeado extra para cada grupo. Incubar os pratos da cultura em 5% CO2 em 37 ° c por 18 h. 2. preparação dos reagentes Diluir uma solução padrão interna comercial, incluindo sulfona de L-metionina e ácido d-cânfora-10-sulfônico 1000-fold em água ultrapura.Nota: para menos de 80 amostras, basta misturar 50 μL da solução padrão interna 1 e 45 mL de água ultrapura num balão volumétrico de 50 mL e, em seguida, levar a solução até 50 mL com água ultrapura. Prepare uma solução de manitol de 0, 5 g/mL em água ultrapura como tampão de lavagem.Nota: para menos de 30 amostras, basta Dissolver 25 g de manitol em 500 mL de água ultrapura. Aproximadamente 15 mL de tampão de lavagem são exigidos por prato de cultura de 100 mm, então prepare um volume suficiente de tampão de lavagem de acordo com o número de amostras. 3. pre-lavagem centrífuga unidades de filtro Pipetar 250 μL de água ultrapura para o copo filtrante de cada unidade de filtro centrífugo (ver a tabela de materiais).Nota: duas unidades de filtro por amostra são necessárias. Tampe firmemente as unidades filtrantes e centrifugue a 9.100 × g a 4 ° c durante 5 min. Verifique o volume de cada filtrado — se o filtrado significativo acumulou durante a primeira rotação curta, a unidade de filtro pode estar defeituosa. Nesse caso, descarte a unidade de filtro e use uma nova unidade de filtro. Feche firmemente as tampas das unidades filtrantes e centrifugue novamente a 9.100 × g a 4 ° c durante 30 min. Assegure-se de que nenhuma água ultrapura permaneça em alguns dos copos do filtro; Remova a água de ultrapura filtrada em cada tubo de coleta com uma pipeta e descarte.Nota: não tente remover a água residual num copo de filtro com uma pipeta, pois pode danificar o filtro. Substitua os copos de filtro em seus tubos de coleta.Nota: Use as unidades centrífugas do filtro dentro de uma hora desde que os filtros podem se tornar danificados em cima da secagem. 4. cultura celular no dia 2 Tire os pratos de cultura de 100 mm da incubadora.Nota: a duração da cultura de célula recomendada é 18 h. Aspirar o meio de cultura celular de cada prato de cultura de 100 mm. Adicionar 10 mL de meio de cultura celular que inclui as concentrações apropriadas de compostos ou drogas para cada prato, tendo o cuidado de não perturbar a camada celular.Nota: para fins de demonstração, foram acrescentados 10 μL de 250 mM de diamida dissolvida em PBS (concentração final de 250 μM) neste experimento. Incubar os pratos de cultura a 37 ° c por 30 min na presença de diamida ou PBS como controle. Aspirar o meio de cultura celular de cada prato de cultura de 100 mm. Lave as células adicionando suavemente 2 mL de solução de manitol a 5% à borda de cada prato, tendo o cuidado de não perturbar a camada celular, em seguida, incline levemente o prato.Nota: a PBS ou solução salina interfere com a análise metabolomica baseada em CE-MS e afeta negativamente os resultados da medição e, portanto, não deve ser usada como tampão de lavagem. Aspirar o tampão de lavagem de cada prato de cultura, em seguida, lave as células novamente, adicionando suavemente 10 mL de tampão de lavagem por prato e levemente inclinando o prato. Aspirar completamente o tampão da lavagem da borda de cada prato da cultura.Nota: aspirar o máximo de tampão de lavagem possível, prestando atenção para não aspirar as células. O manitol residual pode interferir na análise da CE-MS; aspiração de células diminuirá o número de células e, portanto, se tornará uma fonte de erro na normalização de dados. 5. extração de metabólitos de células cultivadas Adicionar 800 μL de 99,7% de metanol por prato de cultura. Balanç delicadamente cada prato da cultura para a frente e para trás para cobrir sua superfície inteira. Deixe os pratos à temperatura ambiente por 30 s. Adicione lentamente 550 μL da solução padrão interna diluída por prato, imersando a ponta da pipeta no metanol e pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Balanç delicadamente cada prato da cultura para a frente e para trás para cobrir sua superfície inteira. Deixe os pratos à temperatura ambiente por 30 s. 6. ultrafiltração de extratos celulares Transfira a solução extraída de cada prato de cultura para um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mL. Centrifugue os tubos a 2.300 × g a 4 ° c durante 5 min. Transferir 350 μL de cada sobrenadante em duas unidades filtrantes centrífugas por amostra.Nota: a partir de cada prato de cultura, um total de 700 μL da solução extraída é transferido para dois tubos de filtro (350 μL/tubo). Centrifugue os tubos de filtro a 9.100 × g a 4 ° c durante aproximadamente 2 h até que nenhum líquido permaneça nos copos de filtro. Retire os copos de filtro e feche firmemente as tampas dos tubos de recolha. 7. evaporação da amostra Prepare um evaporador centrífugo — tipicamente, isto consiste em um evaporador, em uma armadilha fria, e em uma bomba de vácuo. Coloque os tubos de coleta no evaporador centrífugo.Nota: Deixe as tampas dos tubos abertos. Evate as soluções extraídas da amostra condições do vácuo na temperatura ambiente.Nota: as configurações típicas para o número de rotações e a pressão são 1.500 RPM e 1.000 PA, respectivamente, e toma geralmente aproximadamente 3 h para evaporar completamente as amostras. Confirme que nenhum líquido permanece em nenhum dos tubos de coleta e feche as tampas dos tubos firmemente. Armazene os tubos da coleção em um congelador profundo da temperatura ultra-baixa (− 80 ° c) até a análise Metabolômica. 8. análise metabolomic por CE-MS Ressuscitem o filtrado em 50 μL de água ultrapura imediatamente antes da análise CE-MS. Executar a análise CE-MS por métodos descritos anteriormente12,13 usando sistema de eletroforese capilar e tempo de vôo sistema de espectrómetro de massa equipado com uma bomba isocrática, um adaptador CE-MS, e um CE-ESI-MS pulverizador.Nota: ambos os sistemas podem ser controlados pelo software dos vendedores do sistema e são conectados por um capilar fundido de sílica (50 μm de diâmetro interno × 80 cm de comprimento total). Configure instrumentos e frascos de amostra, prepare o capilar com uma gaveta capilar, Reabasteça os líquidos da bainha e os buffers de eletroforese apropriados, dependendo do modo de análise de anion ou cation, e depois aplique tensões.Nota: a instrumentação e as condições analíticas são descritas em detalhe em outra parte12,13. Abra o software e prepare uma lista de trabalho contendo métodos de aquisição de dados e informações de amostra. Inicie uma execução de teste e verifique os dados, como a intensidade do sinal e a forma de pico de padrões internos e a resolução de pico de outros compostos padrão. Afinar as condições analíticas, se necessário. Injete as soluções de amostra em 50 mbar por 3 s e uma voltagem de 30 kV.Nota: o CE-MS foi conduzido tanto no modo de íon positivo ou negativo. Ajuste o espectrómetro para digitalizar o intervalo de massa m/z 50 – 1000. A tensão capilar foi ajustada em 4 kV; a taxa de fluxo do gás do nitrogênio (temperatura 300 ° c do calefator). Para a modalidade positiva, a tensão do fragmentor, do skimmer e do OCT RFV foi ajustada em 75, em 50 e em 125 V, respectivamente. Para a modalidade negativa do íon, o fragmentor, o skimmer, e a tensão de OCT RFV foram ajustados em 100, em 50, e em 200 V, respectivamente. Analise dados de espectro. Extraia picos dos dados espectrais de massa usando o software de integração automática para obter informações de pico, incluindo m/z, área de pico e tempo de migração (MT).Observação: o método é descrito em detalhes em outro lugar14. Exclua picos de sinal correspondentes a isotopomeros, íons aduto e outros íons de produto de metabólitos conhecidos. Anote os picos restantes com informações do banco de dados do metabolito HMT de acordo com valores m/z e mts. Normalize áreas dos picos anotados para níveis padrão internos e números de células por amostra. Avaliar a concentração de cada metabolito nas células cultivadas (pmol/106 células) utilizando curvas padrão preparadas para cada metabolito. Utilizar as concentrações quantificadas de metabolito para análises estatísticas subsequentes e interpretações biológicas14.