毛細血管電気泳動質量分析によるメタボロミクス解析のための培養付着細胞からの水性代謝産物の抽出

1. 細胞培養1日目 注: 代謝物抽出の各サンプルは、適度ではあるが完全にコンフルエントではない単一の 100 mm 組織培養皿から調製する必要があります (約2〜500万個の細胞を含む)。アッセイに必要な皿の数を計算し、それに応じて準備します。 培養 HCC827 および PC-9 細胞を37° cで 5% の培地にて、10% ウシ胎児血清 (FBS) を添加した RPMI-1640 中。 100 mm 培養皿から細胞培養培地を吸引する。 カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 溶液2ml を使用して、各皿の細胞を洗浄します。PBS 溶液が皿の表面を完全に覆うように、優しく各皿をロックします。 培養皿から洗浄緩衝液を吸引除去する。 0.25% トリプシン-EDTA 溶液を37° c に加温し、5 mL 血清学的ピペットを使用して 2 mL のトリプシン EDTA 溶液を加えます。トリプシンが皿の表面を完全に覆うように、それぞれの皿を静かに揺らします。 37° c で約5分間培養皿をインキュベートします。 1皿あたり 4 mL の予温めた完全な成長培地を加えます。セルを再懸濁にそっとピペットで押し込みます。 各細胞懸濁液を別個の 15 mL 円錐管に移し、800× gで5分間遠心分離する。 再懸濁は、各細胞ペレットを 2 mL の予加温された完全な増殖培地中に収めた。 自動セルカウンタおよび 0.4% トリパンブルーソリューションを使用して、セルの合計数と実行率を決定します。 10μ l の細胞懸濁液と10μ l の 0.4% トリパンブルー溶液を混合します。 毛管作用によって細胞数える部屋のスライドにサンプルの10のμ l を荷を積む。 チャンバースライドを自動セルカウンタに挿入します。透過光が自動的に点灯し、機器がセルに焦点を合わせます。 キャプチャボタンを押して画像をキャプチャし、結果を表示します。 必要に応じて、さらに成長培地を加えて、所望の細胞濃度を得る。 種子は100ミリメートル細胞培養皿あたり約1〜250万細胞である。注: CE 分析によって決定される代謝産物濃度は、生存細胞数に基づいて正規化されます。細胞計数を目的として、各群について少なくとも1種の余分な播種培養皿を調製することが必要である。 5% CO2 で37° c で培養皿を18時間インキュベートします。 2. 試薬の調製 超純水で L-メチオニンスルホンおよびd-樟脳-10-スルホン酸1000を含む商業内部標準液を希釈します。注:80 サンプル未満の場合は、内部標準溶液1と 45 mL の超純水を 50 mL のメスフラスコに50混合し、その後、最大で 50 mL の超純水で溶液を使用してください。 洗浄緩衝液として超純水に 0.05 g/mL マンニトール溶液を調製します。注: サンプル数が30未満の場合は、500ミリリットルの超純水で 25 g のマンニトールを単に溶解します。100 mm 培養皿あたり約 15 mL の洗浄緩衝液が必要となりますので、サンプル数に応じて十分な量の洗浄バッファーを用意してください。 3. 予洗浄用遠心フィルターユニット 各遠心フィルターユニットのフィルターカップに250μ l の超純水をピペットで入れます (材料の表を参照してください)。注: サンプルごとに2つのフィルタユニットが必要です。 フィルターユニットをしっかりとキャップし、4° c で9100× gで5分間遠心分離してください。 各濾液の量を確認してください—重要な濾液が最初の短いスピンの間に蓄積された場合、フィルタユニットは欠陥であり得る。この場合、フィルタユニットを破棄し、代わりに新しいフィルタユニットを使用してください。 フィルターユニットの蓋をしっかり閉め、4° c で9100× gで30分間遠心分離してください。 どのフィルターカップにも超純水が残っていないことを確認してください。各回収管にある超純水をピペットで取り出し、廃棄します。注: フィルタを損傷する可能性があるため、ピペットでフィルターカップ内の残留水を除去しないでください。 フィルターカップを回収チューブに交換してください。注: フィルターが乾燥時に損傷する可能性があるため、1時間以内に遠心フィルターユニットを使用してください。 4. 2 日目の細胞培養 インキュベーターから 100 mm の培養皿を取り出します。注: 推奨される細胞培養持続時間は18時間です。 各 100 mm 培養皿から細胞培養培地を吸引する。 各ディッシュに化合物または薬剤の適切な濃度を含む 10 mL の細胞培養培地を加え、細胞層を乱さないように注意する。注: 実証目的で、この実験では PBS に溶解した 250 mM ビステアリルエチレンジアミド (最終濃度250μ m) を10μ l 添加しました。 ビステアリルエチレンジアミドまたは PBS のコントロールとして、37° c で30分間培養皿をインキュベートします。 各 100 mm 培養皿から細胞培養培地を吸引する。 各皿の縁に 5% のマンニトール溶液 2 mL をそっと加えて、細胞層を乱さないように注意し、その後、皿をわずかに傾けることによって細胞を洗浄する。注: PBS または食塩水溶液は、CE MS ベースのメタボロミクス分析に干渉し、測定結果に悪影響を及ぼすため、洗浄緩衝剤として使用しないでください。 各培養皿から洗浄緩衝液を吸引し、皿1本あたり 10 mL の洗浄緩衝液を加えて軽く傾けることによって再び細胞を洗浄する。 各培養皿の端から洗浄緩衝液を完全に吸引する。注: 細胞を吸引しないことに注意を払いながら、できるだけ多くの洗浄バッファーとして吸引します。残留マンニトールは、CE-MS 分析を妨げる可能性があります。細胞の吸引は、セルの数を減少させ、したがって、データの正規化におけるエラーの原因となります。 5. 培養細胞からの代謝物の抽出 培養皿1本当たり800μ l の 99.7% メタノールを添加する。各文化料理を前後に優しく揺らし、表面全体を覆います。皿は30秒間室温で残しておきなさい。 ピペットの先端をメタノールに浸し、数回ゆっくりと上下にピペッティングすることにより、皿あたりの希釈された内部標準溶液の550μ l をゆっくりと加えます。 各文化料理を前後に優しく揺らし、表面全体を覆います。 皿は30秒間室温で残しておきなさい。 6. 細胞抽出物の限外濾過 抽出した溶液を各培養皿から別の 1.5 mL マイクロ遠心チューブに移す。 4° c で2300× gで5分間チューブを遠心します。 各上清の350μ l をサンプルあたり2つの遠心フィルターユニットに移す。注: 各培養皿から、抽出された溶液の合計700μ l を2つのフィルターチューブ (350 μ l/チューブ) に移した。 フィルター・カップに液体が残っていない状態になるまで、約2時間、4° c で9100× gでフィルターチューブを遠心します。 フィルターカップを取り外し、回収チューブの蓋をしっかりと閉めます。 7. 試料の蒸発 遠心蒸発器を準備する-通常、これは、蒸発器、コールドトラップ、および真空ポンプで構成されています。 回収チューブを遠心蒸発器に入れます。注: チューブの蓋は開いたままにしておきます。 室温で真空条件下で抽出したサンプル溶液を蒸発させる。注: 回転および圧力の数の典型的な構成はそれぞれ 1500 rpm および 1000 Pa であり、通常サンプルを完全に蒸発させるためにおよそ 3 h かかります。 収集チューブのいずれにも液体が残っていないことを確認し、チューブの蓋をしっかり閉めます。 収集チューブは、メタボロミクス分析まで超低温 (−80° c) の深い冷凍庫に保管してください。 8. メタボロミクス分析 (CE MS) 再懸濁分析直前の超純水50μ l の濾液を測定した。 アイソクラティックポンプ、ce-ms アダプタ、および ce-ESI 噴霧器を搭載した毛細血管電気泳動システムと飛行時間の質量分析計システムを使用して、前述の12,13に記載された方法によって CE-ms 分析を実行します。注: 両方のシステムは、システムベンダーのソフトウェアによって制御することができ、溶融シリカ毛細管 (50 μ m 内径× 80 cm の全長) によって接続されています。 装置およびサンプルバイアルをセットアップし、毛管カセットで毛細管を準備し、アニオンまたは陽イオン分析モードに応じてシース液と適切な電気泳動バッファーを補充してから、電圧を印加します。注: 計測および解析条件については、他の12,13で詳しく説明します。 ソフトウェアを開き、データ取得方法とサンプル情報を含むワークリストを準備します。 テスト実行を開始し、信号強度、内部標準のピーク形状、その他の標準化合物のピーク分解能などのデータを確認します。 必要に応じて解析条件を微調整します。 3 s 用に 50 mbar、30 kV の電圧でサンプル溶液を注入します。注: CE-MS は、正または負のイオンモードのいずれかで行われました。質量範囲m/z 50-1000 をスキャンするように分光器を設定します。毛管電圧は4つの kV で置かれた;窒素ガスの流量 (ヒータ温度300° c)。ポジティブモードの場合、fragmentor、スキマーおよび OCT RFV 電圧は、それぞれ75、50および 125 V に設定されました。マイナスイオンモードでは、fragmentor、スキマー、OCT RFV の電圧をそれぞれ100、50、200 V に設定しました。 スペクトラムデータを分析する。 自動統合ソフトウェアを使用して質量スペクトルデータからピークを抽出し、 m/z、ピーク領域、および移行時間 (MT) などのピーク情報を取得します。注: この方法については、他の14で詳しく説明します。 Isotopomers、付加物イオン、および公知の代謝産物の他の生成物イオンに対応するシグナルピークを除外する。 M/z値および MTs に従って、HMT 代謝物データベースからの情報で残りのピークに注釈を付けます。 注釈付きピークの領域を、内部標準レベルとサンプルあたりのセル数に正規化します。 各代謝産物について調製した標準曲線を用いて培養細胞 (pmol/106 細胞) 中の各代謝産物の濃度を評価する。 その後の統計的分析および生物学的解釈のために定量化された代謝物濃度を使用する14.