Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana

S. aureus resistente à meticilina (MRSA) é a principal causa de infecção associada à saúde e a resistência antibiótica associadaé um desafio clínico considerável^1,2,3. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas é uma prioridade alta. Uma estratégia de tratamento promissora para patógenos gram-positivos está inibindo a síntese de ácidos graxos, uma exigência para a produção de fosfolipídios de membrana que, em S. aureus, inclui fosfatidilglicerol (PG), lysyl-PG e cardiolipina⁴. Em bactérias, a produção de ácidos graxos ocorre através da via de síntese de ácidos graxos II (fasii)⁵, que é consideravelmente diferente da contraparte eucariótica, tornando fasii um alvo atrativo para o desenvolvimento de antibióticos^5,6 . Os nervos inibidores de FASII primeiramente alvo FabI, uma enzima exigida para o alongamento da corrente do carbono do ácido gordo⁷. O inibidor da Fabi Triclosan é amplamente utilizado em bens de consumo e de saúde^8,9. Inibidores adicionais de Fabi estão sendo desenvolvidos por diversas empresas farmacêuticas para o tratamento da infecçãopor S. aureus ^{10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26}. No entanto, muitos patógenos gram-positivos, incluindo S. aureus, são capazes de eliminar os ácidos graxos exógenos para a síntese de fosfolipídios, contornando a inibição do fasii^27,28,29. Assim, o potencial clínico dos inibidores do fasii é debatido devido a lacunas consideráveis em nosso conhecimento sobre as fontes de ácidos graxos hospedeiros e os mecanismos pelos quais os patógenos extraem ácidos graxos do hospedeiro^27,28. Para abordar essas lacunas, desenvolvemos um método de análise lipidomica imparcial para monitorar a incorporação de ácidos graxos exógenos de partículas de lipoproteínas em fosfolipídios de membrana de S. aureus.

Durante a sepse, as partículas de lipoproteínas hospedeiras representam uma fonte potencial de ácidos graxos derivados do hospedeiro dentro da vasculatura, pois a maioria dos ácidos graxos hospedeiros está associada às partículas³⁰. As lipoproteínas consistem em um escudo hidrófilo composto de fosfolipídios e proteínas que envolvem um núcleo hidrofóbico de triglicerídeos e ésteres de colesterol³¹. Quatro classes principais de lipoproteínas–chylomicron, lipoproteína muito de baixa densidade, lipoproteína de alta densidade, e lipoproteína de baixa densidade (LDL)-são produzidos pelo hospedeiro e funcionam como veículos de transporte lipídico, entregando ácidos graxos e colesterol de e para células hospedeiras através da vasculatura. Os LDLs são abundantes em ácidos graxos esterificados, incluindo triglicerídeos e ésteres de colesterol³¹. Nós temos demonstrado previamente que os LDLs humanos altamente purified são uma fonte viável de ácidos gordos exógenos para a síntese do PG, assim fornecendo um mecanismo para o desvio³²do inibidor de fasii. As LDLs humanas purificantes podem ser tecnicamente desafiadoras e demoradas, enquanto as fontes comerciais de LDLs humanas purificadas são proibitivamente caras de usar em uma base rotineira ou para realizar telas bacterianas em grande escala. Para abordar estas limitações, nós modificamos um procedimento para o enriquecimento de LDLs da gema de ovo da galinha, uma fonte rica de partículas do lipoproteína³³. Nós usamos com sucesso a espectrometria maciça unalvejada, de alta resolução/exata e a espectrometria maciça em tandem para monitorar a incorporação de ácidos gordos LDL-derivados humanos na membrana de S. aureus³². Ao contrário dos métodos previamente relatados, esta aproximação pode quantificar isómeros individuais do ácido gordo para cada um dos três tipos estafilocócica principais do fosfolipídeo. O ácido oleico (18:1) é um ácido graxo insaturado presente em todas as partículas de lipoproteínas hospedeiras que é prontamente incorporada aos fosfolipídeos de S. aureus ^29,30,32. S. aureus não é capaz de síntese de ácido oleico²⁹; Portanto, a quantidade de ácido oleico incorporado ao fosfolipídios estabelece a presença de ácidos graxos derivados da lipoproteína hospedeira dentro da membrana estafilocócica²⁹. Estas espécies de fosfolípidos podem ser identificadas pelo método de espectrometria de massas de última geração descrito aqui, oferecendo uma resolução sem precedentes da composição da membrana de S. aureus cultivada na presença de uma fonte de ácidos graxos que provavelmente encontros durante a infecção.