세균성 인공 염색체 cDNA 클론에서 재조합 Zika 바이러스의 구조

1. BAC에서 ZIKV 전염성 cDNA 클론의 건설 참고: BACs에서 ZIKV의 조립을 위한 전략은 RGN 균주 13(수탁 번호 KU527068)에 대해 설명된다(도 2). 플라스미드 pBeloBAC11(도 2A)에 없는 바이러스 게놈에적절히 이격된 독특한 제한 부위를 선택한다.참고: ZIKV-RGN의 경우, 제한 부위Pml I, Afe I 및 BstB I(게놈 위치 3,347, 5,969 및 9,127)을 각각 선택하였다. 바이러스 게놈에서 적절한 제한 부위를 사용할 수 없는 경우, cDNA 단편 설계 동안 바이러스 게놈에 침묵하는 뉴클레오티드 돌연변이를 도입하여 새로운 제한 부위를 생성한다. 화학 적 합성에 의해 생성 된 전신 게놈에 걸쳐 4 cDNA 조각 (Z1 에 Z4), 5’끝에서 CMV 프로모터에 의해 측면 및 HDV RZ, BGH 종단, 및 3’끝에서 폴리 아데닐화 서열 (그림 2B). 각 조각은 선택한 제한 사이트(1.1단계)에 의해 측면에 있어야 합니다.참고: 조각 Z1은 pBeloBac11의 나머지 조각을 복제하기 위한 백본으로 사용됩니다. 이를 위해, 인간 CMV 프로모터를 포함해야 하며, ApaL I(pBeloBAC11에서 이 단편을 복제하기 위해)와 Asc I(바이러스 게놈에 결석함)에 의해 5′-끝에서 측면으로 측면화되어야 하며, 3′-끝에서 감염성 클론의 조립을 위해 선택된 제한 부위(Pml I)에 의해 선택되어야 합니다. , Afe I, 및 BstB I)는 Mlu I(바이러스 게놈에 결석) 및 BamH I(pBeloBAC11에서 이 단편을 복제하기 위해)를 따랐다. Z4 단편은 선택된 마지막 제한 부위(BstB I)로부터 바이러스 게놈의 끝까지, HDV RZ, BGH 종단 및 폴리아데닐화 서열, 및 Mlu I 제한 부위(도2B)를포함해야 한다. 대안적으로, cDNA 단편(Z1-Z4)은 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표준 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 및 중첩된 PCR의 조합에 의해 생성될 수 있다. pBeloBAC11 (그림2B)에Z4 단편 Z1의 순차적 복제에 의해 전염성 cDNA 클론을 조립한다. pBeloBAC11 플라스미드 및 Z1 단편을 ApaL I 및 BamH I로 소화한다. 이를 위해 pBeloBAC11 플라스미드 2 μg 또는 Z1 단편 1 μg를 10x 반응 완충액, 각 효소의 20 단위, 물 100 μL의 최종 부피에 도달하도록 2 μg의 2 μg를 2 시간 동안 37°C에서 배양합니다. 새우 알칼리성 인산염(SAP)을 이용하여 BAC 벡터를 배분한다. 이를 위해, 소화된 BAC에 SAP 2.5 μL(2.5 단위)을 넣고 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션하여 75°C에서 15분 동안 인큐베이션하여 SAP를 불활성화시다. 10 kb보다 큰 DNA 단편의 정제에 최적화된 상용 겔 클렌징 키트를 사용하여 아가로즈 겔 전기영동에 의한 탈인성 BAC 벡터 및 단편 Z1을 정제한다(재료표 참조). 결찰 반응을 수행하여 플라스미드(p)BAC-Z1을 생성한다. 이를 위해, 정제된 BAC 벡터의 150 ng를 정제된 BAC 벡터와 혼합하여 벡터 대 삽입의 몰 비를 사용하여 1:3, 10x T4 DNA 리가제 완충액의 10mM ATP, 1단위의 T4 DNA 리가제, 및 15 μL의 최종 부피로 물을 삽입한다. 16 °C에서 20 시간 동안 결찰 혼합물을 배양합니다. 결찰 반응의 제어로서, 인서트가 없는 결찰 반응을 병렬로 수행한다. 열-15 분 동안 65 °C에서 배양하여 리가아를 비활성화합니다.참고: 무딘 말다이드 DNA의 경우, 14°C에서 20시간 동안 결찰 반응을 배양한다. BAC 벡터(도 2A)의크기가 크기 때문에, 결찰 효율을 높이기 위해서는 기존의 플라스미드를 이용한 결찰보다 더 많은 양의 벡터 및 삽입물을 사용하는 것이 필수적이다. 0.2 간격으로 이격된 전극이 장착된 전기 포출 큐벳을 사용하여 전기 간화(25 μF 커패시턴스, 2.5 kV 및 100Ω 저항)에 의한 결찰 반응(단계 1.3.5)의 2 μL로 대장균 DH10B 전기 적격 세포 50 μL 변환 cm, 표준 프로토콜을 따르십시오. SOC 배지 1 mL (2% 트립톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.05 % NaCl, 2.5 mM MgCl, 10mM MgCL 2, 10 mM MgSO4,20 mM MM 포도당 [pH 7.0])을 가진 폴리 프로필렌 튜브로 세포를 옮기고 1 시간 동안 37 ° C에서 20 h로 배양하십시오 (20 h). 12.5 μg/mL 클로람페니콜을 함유한 루리아 국물(LB) 한천 접시에 세포를 플레이트하고 16시간 동안 37°C에서 배양합니다. 8~12개의 세균 성 콜로니를 선택하고, 12.5 μg/mL 클로람페니콜을 함유한 신선한 LB 한천 접시에 복제하고, 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하여 직접 PCR 분석을 통해 올바른 삽입을 포함하고 있는지 테스트합니다. 복제판에서 양성 콜로니를 선택하고, 클로람페니콜 12.5 μg/mL을 함유하는 LB의 100 mL에서 성장시키고, 상업용 플라스미드 미디 키트를 사용하여 알칼리성 용해 방법으로 BAC cDNA를 분리하고, 대형 정제를 위한 권고에 따라 낮은 복사 플라스미드(재료 표참조).참고: 이 방법에 의해 제조된 BAC cDNA는 세균 게놈 DNA의 최대 30%로 오염될 수 있지만, 제한 분석, 시퀀싱 및 복제를 수행하는 데 품질에 적합하다. BAC 크기에 따라, BAC 플라스미드의 4-6 μg의 수율을 얻을 수 있다. 제한 분석을 통해 복제된 cDNA의 유전적 무결성을 확인합니다. pBAC-Z1 플라스미드의 500 ng를 Asc I 및 Pml I와 함께 37°C에서 1시간 동안 소화하고 겔 전기영동에 의한 Z1 단편의 존재를 확인하였다. 원치 않는 돌연변이가 도입되지 않았다는 것을 추가로 확인하기 위해, 특정 올리고뉴클레오티드로 삽입을 서열화한다. 선택된 제한 부위(Pml I, Afe I, BstB I 및 Mlu I)를 포함하는 플라스미드 pBAC-Z1로부터 시작하여, 순차적으로 Z2를 Z4로 복제하여전신 전염성 cDNA 클론 pBAC-ZIKV(그림 2B)를 생성하고, 유사한 실험을 하였다. 조각 Z1에 대해 위에서 설명한 대로 접근 방식입니다(단계 1.3.1-1.3.10). 2. 전염성 rZIKV의 구조에 대한 고순도 pBAC-ZIKV의 준비 참고: 감염성 바이러스의 형질 감염 및 구조에 적합한 초순수 pBAC-ZIKV 감염 클론의 대규모 제제는 BAC 정제를 위해 특별히 개발 된 상용 키트로 알칼리 성 용해로 수행됩니다 (표 참조 재료)를 참조하십시오. 키트는 세균성 게놈 DNA 오염을 제거하는 ATP 의존성 외핵성 소화 단계를 포함해야 하며, 염화 세슘 방법으로 얻은 것과 유사한 순도등급으로 BAC cDNA를 분리할 수 있도록 한다. 37°C에서 12.5 μg/mL의 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지 의 5 mL에서 pBAC-ZIKV 전염성 클론을 운반하는 대장균 DH10B의 단일 콜로니를 8시간 동안 부드럽게 흔들어 (200-250 rpm). 2L 플라스크에 클로람페니콜 12.5 μg/mL로 LB의 500 mL에 1 mL의 세균 배양(단계 2.1)을 추가하고 14-16시간 동안 37°C에서 세포를 성장시다(OD600 0.6-0.8).참고: 훌륭한 국물 (TB)과 같은 풍부한 국물은 매우 높은 세포 밀도를 생성하여 BAC cDNA의 수율이 낮고 순도가 낮습니다. BAC 정제를 위해 특별히 개발된 상용 키트를 사용하여 알칼리성 용해로 BAC 전염성 cDNA 클론을 정제하고, 제조사의 사양에 따라(재료표 참조). 정제된 BAC cDNA를 4°C에서 유지합니다. BAC 크기에 따라, 30 μg의 초순수 BAC cDNA 클론의 수율을 얻을 수 있다.참고: DNA 펠릿을 5분 이상 건조시키지 마십시오. BAC cDNA 클론의 크기가 크기 때문에, 플라스미드 전단을 방지하기 위해 와류 또는 파이펫팅을 피하십시오. 3. 베로 세포의 형질 감염에 의한 BAC cDNA 클론에서 전염성 rZIKV의 구조 참고: 전염성 rZIKV는 pBAC-ZIKV cDNA 클론을 사용한 베로 세포의 형질감염에 의해 회수되고, 상업적 인 양이온 지질 형질전환 시약을 사용한다(물질표 참조; 그림3). 형질감염 하루 전, 6웰 플레이트에 접시 5 x 105 베로 세포/성장 배지에서 잘 (덜베코의 수정 된 독수리의 매체 [DMEM] 5% 태아 소 혈 청으로 보충 [FBS], 2 mM L-글루타민, 그리고 1% 비필수 아미노산) 항생제 없이 90% 동시 세포 단층을 올릴 수 있습니다.참고: 우리는 삼중에서 바이러스 복구를 수행하는 것이 좋습니다. 상온에서 혈청 감소 배지(재료 표 참조)를 평형화하고 각 형질감염 샘플에 대해 멸균 마이크로퍼지 튜브에 형질전환 혼합물을 제조한다. 혈청 환원 배지 250 μL에 BAC cDNA 클론 4 μg를 추가하고 조심스럽게 섞어서 플라스미드 전단을 방지합니다. 별도의 튜브에서 12 μL의 형질감염 시약 (1 mg / mL)을 희석 (재료 표참조)에서 혈청 감소 배지의 250 μL에서, 와르싱으로 혼합하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 희석 된 BAC cDNA와 형질 감염 시약 (DNA : 형질 감염 시약의 1 : 3 비율)을 결합하고 소용돌이를 피하면서 조심스럽게 혼합하고 실온에서 20-30 분 동안 배양하십시오. BAC cDNA /형질 감염 시약 혼합물의 잠복기 동안 항생제없이 성장 배지로 Vero 세포를 씻어 내고 항생제없이 신선한 배지의 1 mL에 세포를 둡니다.참고: 형질감염 과정 동안 항생제를 첨가하면 형질감염 효율이 저하될 수 있다. BAC cDNA/형질감염 시약 혼합물의 500 μL을 베로 세포 상에 분배하고, 플레이트를 앞뒤로 흔들어 혼합하고, 6시간 동안 37°C에서 5% CO2 가습 인큐베이터에서 세포를 인큐베이터화한다. 형질감염 배지를 제거하고, 항생제(100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신)로 2 mL의 신선한 성장 배지를 추가하고, 37°C에서 5% CO2 가습 인큐베이터에서 세포를 배양하고, 세포병증 효과(CPE)의 유도를 매일 확인합니다. ).참고: ZIKV CPE는 베로 세포에서 매우 두드러지며 조직 배양 상수에서 분리되고 부유하는 둥근 및 이중 성 세포의 존재를 특징으로합니다. 베로 세포 조직 배양 과자(단계 3.5)의 aliquots(100 μL)를 매 24시간마다 수집하여 신선한 베로 세포에 대한 표준 플라크분석(도 4A)을 사용하여 ZIKV의 존재를 평가함으로써 바이러스 회복의 효율을 결정한다(도 4A). 4 내지 6일간의 형질전환 후, CPE가 약 50%-75%(도4B)일때, 세포 이물질을 제거하기 위해 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 15 mL 원엽관 및 원심분리기에서 조직 배양 과식제를 수집한다. rZIKV를 함유한 상피제를 수확하고 세포 펠릿을 버린다. 저온화에 상온자를 알리쿼트하고 -80°C에 저장하여 구조된 rZIKV의 존재를 추가로 확인하였다. 4. 복구 된 rZIKV의 적정 적정 전날, 12웰 플레이트에 2.5 x 105 베로 세포/잘 성장 배지에 시드를 올려 적정시에 의해 90% 동시 세포 단층을 올립니다.참고: 우리는 삼중에서 회수 된 rZIKV의 적정을 수행하는 것이 좋습니다. 냉동고에서 상급물의 알리쿼트(단계 3.8)를 제거하고 FBS 없이 성장 배지에서 직렬 10배 희석을 합니다. 인산염 완충 식염수(PBS)로 베로 세포를 2x 세척하고 각 바이러스 희석액을 3배로 희석시 200 μL/well을 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에 놓고 90분 동안 매 15분마다 바위를 채취합니다. 바이러스 성 접종을 제거하고, 2% FBS, 1% DEAE-dextran 및 0.6% 한천 노블을 함유하는 성장 배지의 2 mL로 세포를 중첩시키고, 3-4일 동안 5% CO2 미만에서 37°C에서 배양한다.참고: 아가로즈, 메틸셀룰로오스 또는 기타 오버레이 미디어를 사용할 수 있다. 적절한 플라크 형성 시간은 사용되는 오버레이 및 ZIKV 변형에 따라 달라집니다. 1 시간 동안 실온에서 PBS에서 희석 된 1 mL / 4 % 포름 알데히드로 ZIKV 감염 세포를 수정하고 오버레이를 제거하고 실온에서 20 % 메탄올에서 0.1 % 크리스탈 바이올로 염색하여 바이러스 성 플라크를 15 분 동안 시각화하십시오. 크리스탈 바이올렛을 버리고 물로 3 x를 씻고 판을 건조시키고 플라크를 수동으로 계산하십시오 (그림4C, 왼쪽 패널). 바이러스 성기는 밀리리터 당 플라크 형성 단위로 계산됩니다 (PFU / ml). 대안적으로, 바이러스 플라크는 팬 플라비바이러스 E 단백질 마우스 단클론 항체(mAb) 4G2(도4C,우측 패널)로 면역염색함으로써 가시화될 수 있다. 면역 염색에 의해 ZIKV 플라크를 평가하기 위해, 위에서 설명한 바와 같이 오버레이 한천을 고정 및 제거한 후(단계 4.5에서) 세포를 PBS로 2배 세척하고 실온에서 15분 동안 PBS에서 0.5% 트리톤-X100의 200 μL/well로 배양하여 이를 투과시한다. 투과 용액을 제거하고, PBS로 세포를 3배 세척하고, 실온에서 1시간 동안 차단 용액(PBS에서 10% FBS)의 200 μL/well으로 차단합니다.참고: 다른 표준 차단 솔루션(예를 들어, PBS에서 2.5% BSA)을 이 단계에서 사용할 수 있다. 차단 용액을 제거하고 37 °C에서 1 시간 동안 차단 용액 (1 μg / mL)에서 희석 된 팬 플라비 바이러스 E 단백질 mAb 4G2의 200 μL / well로 세포를 배양하십시오.참고: 다른 mAb 또는 폴리클로날 항체(pAb)는 바이러스 플라크의 면역 염색 및 검출을 위해 4G2 대신에 사용될 수 있다. 세포를 PBS로 3x 세척하고 37 °C에서 1 시간 동안 차단 용액에서 200 μL의 생체 티닐화 된 항 마우스 보조 항체희석 (제조업체의 권고에 따라)으로 배양하십시오. 이차 항체를 제거하고, PBS로 세포를 4x 세척하고, 제조업체의 사양에 따라 아비딘/비오틴 계 퍼옥시다아제 키트를 사용하여 바이러스 성 플라크를 시각화합니다(재료 표참조). 5. 성공적인 rZIKV 구조 확인 참고: 구조된 바이러스의 동일성을 더욱 확인하기 위해, ZIKV E 단백질 발현은 ZIKV E 단백질에 특이적인 마우스 mAb1176-56을 사용하여 면역형광에 의해 분석된다(도 4D). 이러한 mAb는 PAN-플라비바이러스 E 단백질 mAb 4G2(단계 4.6.3)의 상황과는 반대로 ZIKV E 단백질에 특이적이다. 대안적으로, 바이러스 ID는 시퀀싱을 통해 확인할 수 있다. 면역형광 분석 하루 전에, 종자는 감염 시 90%의 동량 세포 단층을 올리기 위해 성장 배지에서 1 x 105 Vero 세포를 함유하는 24웰 플레이트에 입술을 덮는다. 세포를 PBS로 2x 세척하고 FBS (100 μL / well)없이 성장 배지에서 구조 된 바이러스의 0.5 PFU / 세포의 감염 (MOI)의 복합성으로 감염시 면 삼중 플레이트를 37°C에서 90분 동안 배양합니다. 바이러스 흡착 후, 바이러스 접종을 제거하고, 2% FBS로 신선한 성장 배지0.5 mL를 첨가하고, 37°C에서 37°C에서 48시간 동안 5%CO2 가습 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 조직 배양 상류를 제거하고 실온에서 20 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 150 μL / well로 세포를 고정하고 실온에서 15 분 동안 PBS에서 0.5 % 트리톤 -X100의 150 μL / well로 세포를 투과시하십시오. 투과 용액을 제거하고 PBS로 세포를 3배 세척한 후 실온에서 1시간 동안 150 μL/well의 차단 용액으로 세포를 차단합니다.참고: 세포 검사는 대체 차단 솔루션(예를 들어, PBS에서 2.5% BSA)으로 차단됩니다. 차단 용액을 제거하고 37 °C에서 1 시간 동안 차단 용액 (1 μg / mL)에서 희석 된 ZIKV E 단백질에 특화 된 mAb 1176-56의 100 μL / well으로 세포를 배양하십시오. PBS로 세포를 3배 세척하고, 알렉사 플루어 488-컨쥬게이트 항마우스 이차 항체를 차단 용액으로 100 μL/well으로 실온에서 1시간 동안 배양하고, 차단 용액으로 세포를 광범위하게 세척하고, 150 μL/well of 4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 mg/mL)으로 배양하여 실온에서 1:200을 10분 동안 PBS에서 희석시. PBS로 세포를 3배 세척하고, 안티페이드 장착 매체에 커버슬립을 장착하고(재료 표참조) 형광 현미경으로 샘플을 분석합니다.참고: 장기 보관을 위해 시료를 4°C로 저장하여 빛으로부터 보호하십시오. 6. 바이러스 성 주식의 증폭 및 생성 참고: 일단 구조된 바이러스의 신원이 확인되면 (섹션 5), Vero 세포에 바이러스를 증폭시키고 추가 연구를 위한 바이러스 성 주식을 생성합니다. 90% 합류에서 100 mm x 21 mm 플레이트에서 베로 세포를 성장시키고 앞서 설명한 바와 같이 0.1 PFU/세포의 MOI로 감염시다. CPE가 약 75%(약 48-72h 감염 후)인 경우, 세포 이물질을 제거하기 위해 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 50 mL 원원관 및 원심분리기에서 조직 배양 상급체를 수집한다. rZIKV를 함유한 상급물질을 수확하고 세포 펠릿을 버린다. 상온액을 저온중구에 저장하여 -80°C에 보관합니다. 냉동고에서 바이러스 알리쿼트를 제거하고 앞서 설명한 바와 같이 플라크 분석법으로 바이러스 역가를 결정한다(섹션 4).