JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

واحد خطوه إثراء من الحنفية الموسومة histone deاسيتيل من الفطريات الخيطية الرشاشيات معشش لفحص النشاط الانزيمي

Published: May 01, 2019
doi:
10.3791/59527
, , , ,
1Division of Molecular Biology, Biocenter,Medical University of Innsbruck, 2Biology Department,Maynooth University, 3Maynooth University Human Health Research Institute

Summary

الفئة 1 هيستون deاسيتيل (hdacs) مثل rpda اكتسبت اهميه كاهداف محتمله لعلاج التهابات الفطرية. هنا نقدم بروتوكول لإثراء محدده من الحنفية الموسومة rpda جنبا إلى جنب مع فحص النشاط hdac الذي يسمح في اختبار فعاليه المختبر من مثبطات الحجر هيستون.

Abstract

الفئة 1 هيستون deاسيتيل (hdacs) مثل rpda اكتسبت اهميه كاهداف محتمله لعلاج التهابات الفطرية والتعدين الجينوم من الأيض الثانوية الفطرية. ومع ذلك ، يتطلب فحص المثبطات أنشطه الانزيمات المنقية. منذ الفئة 1 deاسيتيل ممارسه وظيفتها كمجمعات متعددة البروتينات, انها عاده ما تكون غير نشطه عندما أعرب عنها كببتيد واحد في البكتيريا. لذلك ، المجمعات المحلية تحتاج إلى ان تكون معزولة ، والتي ، عندما يتم تطبيق التقنيات التقليدية مثل التبادل الأيوني وحجم الفصل اللوني الاستبعاد ، شاقه وتستغرق وقتا طويلا. وقد تم تطوير التقارب بالترادف كاداه لإثراء المجمعات متعددة البروتينات من الخلايا ، التالي تبين ان تكون مثاليه لعزل الانزيمات الذاتية. هنا نقدم بروتوكولا مفصلا لإثراء خطوه واحده من المجمعات rpda النشطة عبر خطوه تنقيه الاولي من عضال الحنفية-الموسومة rpda من الرشاشيات معشش. ويمكن بعد ذلك استخدام المجمعات المنقية لفحص المثبطات اللاحقة وذلك بتطبيق فحص دياسيتيل. ويمكن الانتهاء من إثراء البروتين مع فحص النشاط الانزيمي في غضون يومين.

Introduction

هيستون دياسياسيس (HDACs) هي الزنك2 +-تعتمد الانزيمات المهدرجة قادره علي أزاله مجموعات اسيتيل من بقايا يسين من histone والبروتينات الأخرى. استنادا إلى تشابه التسلسل ، يتم تجميع HDACs في عده فئات1. في الاونه الاخيره ، والطبقة الفطرية 1 hdac rpda ، وهو من الخميرة الخباز بيكر (ساكاروميسز سيريفيسياي) Rpd3p ، وقد تبين ان تكون ضرورية للمرض الفطرية الانتهازية الرشاشيات تبخير2. ولذلك ، اكتسبت RpdA اهميه كهدف محتمل لعلاج التهابات الفطرية2. تقييم النشاط deاسيتيل في المختبر مهم لتوصيف الخصائص الانزيميه ويسمح لتحديد فعاليه المواد الجديدة لتطوير المثبط. علي الرغم من انه تم الإبلاغ عن التعبير المؤتلف من النسخة المحسنة CODON من HDAC1 البشرية في القولونية في الاونه الاخيره3, محاولات للتعبير عن كامل طول rpda في هذا المضيف فشل4. وعلاوة علي ذلك ، منذ الطبقة الفطرية 1 HDACs مثل RpdA و HosA تمارس وظيفتها كمجمعات متعددة البروتينات ، فمن مواتيه لاستخدام المجمعات المحلية الاصليه للدراسات المثبطات الانزيميه. ومع ذلك ، نظرا للعوامل المثبطة ووجود HDACs مختلفه في lysates الفطرية ، والنشاط الحفاز تقاس في مقتطفات البروتين الكامل منخفضه نسبيا ولا يمكن ان تسند إلى الانزيمات الفردية. وعلاوة علي ذلك ، الدراسات السابقة في الفطريات الخيطية ا. نيدولانز تحديد فئة 2 Hdac ، hdaa ، كما deاسيتيل السائدة في كسور الكروماتوغرافي من مقتطفات الفطرية. التالي ، هناك حاجه إلى العديد من الخطوات تنقيه الكروماتوغرافي التقليدية لفصل النشاط غير HdaA من سلالات الفطرية4. ان إدخال استراتيجية تنقيه التقارب الترادفية (TAP) في A. معشش5 قد خففت بشكل كبير إثراء أنشطه deاسيتيل محدده. وتتكون علامة TAP الاصليه من اثنين من البروتينات a المجالات و ببتيد ملزم كالموديولين (الجمارك) مفصوله بواسطة التبغ البروتيني البروتياز (tev) الانشقاق الموقع6. وهذا يسمح لتنقيه الاصليه والتملص من البروتينات الموسومة بما في ذلك شركائها التفاعل7. عند استخدام البروتينات المخصبة لاختبارات النشاط ، فان الشطف الخفيف تحت الظروف الاصليه عن طريق انشقاق البروتياز هو ميزه هامه لتنقيه العلامة TAP. بروتين GFP الموسومة ، علي سبيل المثال ، يمكن ان تثريها الأجسام المضادة المعباه أيضا ، ومع ذلك ، لا يمكن ان يكون التملص في ظل الظروف الاصليه.

هنا نقدم بروتوكولا مفصلا لإثراء خطوه واحده من المجمعات rpda النشطة عن طريق خطوه تنقيه الاولي من عضال الحنفية الموسومة rpda من a. معشش (مفتش الفصل والانقسام tev) لفحص المثبط اللاحقة تطبيق هيستون الفحص deاسيتيل. كما ثبت ان تكون كافيه ، اقتصر إثراء التقارب علي خطوه تنقيه واحده أيضا لان النشاط الانزيمي تم تخفيضه بشكل كبير بعد اثنين–خطوه تنقيه الحنفية بالمقارنة مع تنقيه مفتش وحده.

ومع ذلك ، فان البروتوكول المقدمة ينبغي كذلك ان تكون قابله للتطبيق لإثراء الانزيمات الموسومة الأخرى المشاركة في التنظيم الكروماتين مثل استيل ترانسفيراسيس ، ميثيل ترانسفيراسيس ، وديموميثاز. من خلال إلحاق الخطوة تنقيه الثانية من بروتوكول TAP ، البروتينات المشتركة تنقيه مع الطعوم الموسومة يمكن اعتبارها شركاء معقده من (رواية) المجمعات الانزيميه.

Protocol

1-زراعه ا. نيدولانز اعداد البويضاتملاحظه: يجب ان يتم تنفيذ كافة الخطوات بصرف الانتباه عن الحضانة تحت خزانه التدفق الرقائقي. 26.0 50 0.5 10.0 80 [ككل], 26.0 [غ] [مسب]4 · 7 ح2س, 76.0 g KH2PO4, 1 مل من كلوروفورم], 1 مل من 1,000 × hutner العناصر النزره8) بما في ذلك 1.5% (w/v) أجار والملاحق المطلوبة كما هو موضح من قبل تود et al. 20079. احتضان لمده 2-3 أيام في 37 درجه مئوية.ملاحظه: TIB 32.1 يحتوي علي Rpda:: صنبور الانصهار التي تسيطر عليها المروج اكسيليز-محبلي ، اكسيليف(ع)10. هذا هو السبب في ادراج الاكلوز في الوصفة المذكورة أعلاه. تجاهل اكسيليز عند تزايد السلالات التي تعبر عن الثوابت التي لا تخضع لسيطرة اكسيليف(ع). اعداد العقيمة 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي مع 1.5 mL من محلول التعليق كونديل العقيمة (CSS ؛ 0.9 ٪ (ث/ف) كلوريد الصوديوم ، 0.01 ٪ (v/v) السكاريد 80). الرطب حلقه التلقيح المتاح في CSS ، كشط قباله كونيديا من لوحه من الخطوة 1.1.1 والتوقف في الأنبوب من الخطوة 1.1.2. نقل 150 μL كل من تعليق كونديل إلى 10 25 سم2 قوارير ثقافة الخلية مع غطاء تنفيس تحتوي علي أجار GXMM بما في ذلك المكملات الغذائية و 200 ΜL من CSS. نشر تعليق كونديل داخل قوارير باستخدام حلقه التلقيح معقمه واحتضان قوارير في 37 درجه مئوية لمده 2-3 أيام. لحصاد الكونيديا ، استخدم 10 مل من CSS للزجاجة الواحدة. صب المحلول في قارورة ، وإغلاق باحكام قارورة مع غطاء المسمار المقدمة ويهز بقوة القارورة. بعد ترطيب سطح الفطرية ، كشط تماما قباله المتبقية كونيديا مع حلقه التلقيح معقمه. تمرير كونيديا من خلال مصافي الخلية 40 μm وضعت علي أنبوب الطرد المركزي العقيمة 50 mL وجمع تعليق خمس قوارير في أنبوب واحد. الطرد المركزي أنبوب في 1,000 × g لمده 10 دقيقه. Decant في ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 10 مل من CSS لكل أنبوب. جمع كل من التعليق في أنبوب واحد ، شطف أنبوب فارغ مع 40 mL من CSS ، أضافه إلى التعليق ، والطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 1.1.9. Decant في ماده طافي وأعاده تعليق بيليه كونيديال في 4 مل من CSS. اعداد اثنين من التخفيفات 1:50 التسلسلي للتعليق كونيديال وتحديد عدد كونيديا في الناتج 1:2 ، 500-المخفف التعليق مع غرفه العد كما هو موضح11. نمو وحصاد ميسيليا اثناء العمل تحت مجلس الوزراء تدفق الرقائقي, تطعيم 4-6 1 لتر قوارير مخروطيه تحتوي كل منها 250 mL من GXMM بما في ذلك المكملات الغذائية المناسبة في كثافة 5 × 106 كونيديا/مل واحتضان في 180 دوره في الدقيقة في 37 درجه مئوية ل 14-16 ح. ضع قطعه قماش الجبن في قمع علي قمة قارورة وتصفيه ميسليا من خلال القماش. يغسل لفتره وجيزة مع الماء منزوع الأيونات. أزاله الرطوبة قدر الإمكان عن طريق الضغط علي ميسليا المحاصرين في القماش الجبن بين اليدين أولا ثم المناشف الورقية. نقل ميسليا المجففة كاوراق مسطحه إلى كوب من البلاستيك مع غطاء المسمار وتجميد فلاش مع النيتروجين السائل. وهذا يضمن ارتفاع نسبه المساحة/الحجم لعمليه التجفيف بالتجميد التالية. تخزين ميسليا المجمدة في-80 درجه مئوية قبل التجميد.ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. بالتجميد الليلي وقف عمليه التجفيف بالتجميد عندما تبقي درجه حرارة الميسيليا ثابته (18 – 24 ساعة). أزاله أكواب وختم فورا مع قبعات المسمار المقدمة.ملاحظه: عندما مختومه باحكام ، يمكن تخزين ميسليا بالتجميد لعده أسابيع في RT. 2. واحد–خطوه إثراء الحنفية–الموسومة HDAC (مقتبسه من Bayram et al. 2012)12 اعداد المخازن المؤقتة والحلولملاحظه: أضافه 2-mercaptoethanol (EtSH) ومثبطات الانزيم البروتيني إلى المخازن المؤقتة مباشره قبل الاستخدام. تصفيه جميع المخازن المؤقتة المستخدمة للكروماتوغرافي من خلال اغشيه النيتروسليلوز 0.22 μm لتجنب إدخال الشوائب/تلوث إلى راتنج اللوني. تشير الإرشادات الواردة في الخطوات أدناه إلى اعداد 1 لتر من كل مخزن مؤقت. تخزين المخازن المؤقتة عند 4 درجه مئوية. استخراج العازلة (B250): 250 mM كلوريد الصوديوم ، 100 mM تريس-HCl pH 7.5 (RT) ، 0.1 ٪ (v/v) TX-100 ، 5 ملم EtSH. تذوب 12.35 غرام من تريس-HCl ، 2.62 غرام من تريس (قاعده حره) ، و 13.2 غرام من كلوريد الصوديوم في 800 مل من الماء منزوع الأيونات وأضافه 10 مل من 10 ٪ (v/v) الحل TX-100. التحقق من درجه الحموضة في RT والتكيف مع الأس الهيدروجيني 7.5 مع اما NaOH أو HCl [5 M] ، إذا لزم الأمر. جعل ما يصل إلى 1 لتر وتصفيه من خلال غشاء النيتروسليلوز 0.22 μm. أضافه 35 μL من EtSH لكل 100 mL من العازلة (5 مم التركيز النهائي) مباشره قبل الاستخدام. غسل العازلة 250 (WB250): 250 mM كلوريد الصوديوم ، 40 mM تريس-HCl pH 8.0 (RT) ، 0.1 ٪ (v/v) TX-100 ، 5 ملم EtSH. اعداد WB250 كما هو موضح ل B250 (2-1-1) ولكن مع 3.59 غرام من تريس-HCl ، و 2.08 غرام من تريس (قاعده حره). غسل العازلة 150 (WB150): 150 mM كلوريد الصوديوم ، 40 mM تريس-HCl pH 8.0 (RT) ، 0.1 ٪ (v/v) TX-100 ، 5 ملم EtSH. اعداد WB150 كما هو موضح ل B250 (2-1-1) ولكن مع 3.59 غرام من تريس-HCl ، 2.08 غرام من تريس (قاعده حره) ، و 8.77 غرام من كلوريد الصوديوم. TEV تاخيرمن العازلة (TEB): 150 mM كلوريد الصوديوم ، 40 mM تريس-HCl pH 8.0 (RT) ، 0.5 mM أدتا ، 0.1 ٪ (v/v) TX-100 ، 5 ملم EtSH. نفس WB150 ولكن أضافه أدتا إلى التركيز النهائي 0.5 mM. TEV الانقسام العازلة (TEV): 150 mM كلوريد الصوديوم ، 40 mM تريس-HCl pH 8.0 (RT) ، 0.5 mM أدتا ، 0.1 ٪ (v/v) TX-100 ، 10 ٪ (v/v) الجلسرين ، 5 ملم EtSH. اعداد كما هو موضح في الخطوة 2-1-1 مع 3.59 غرام من تريس-HCl ، 2.08 غرام من تريس (قاعده حره) ، و 8.77 غرام من كلوريد الصوديوم وأضافه 100 مل من الجلسرين قبل ضبط حجم إلى 1 لتر. 50 الانزيمات البروتينية × المثبطة كوكتيل: حل 1 قرص من كوكتيل المتاحة تجاريا من مثبطات الانزيم البروتيني في 1 مل من الماء وتخزين في-20 درجه مئوية. TBS-T: 50 mM تريس-HCl pH 7.6 (RT) ، 0.9 ٪ (ث/ف) كلوريد الصوديوم ، 0.1 ٪ (v/v) السكاريد 20. اعداد كما هو موضح في الخطوة 2-1-1. استخدام 6.06 غرام من تريس-HCl ، 1.40 غرام من تريس (قاعده حره) ، 9 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 1 مل من السكاريد 20. 5 × LSB (Laemmli المخزن المؤقت عينه): 315 mM تريس-HCl pH 6.8 (RT) ، 25 ٪ (v/v) EtSH ، 50 ٪ (v/v) الجلسرين ، 10 ٪ (ث/الخامس) SDS ، 0.05 ٪ (ث/الخامس) بروموفينول الأزرق. اعداد مستخلص البروتين أضف 1.5 غ من الميسيليا المجففة بالتجميد وكره طحن في جره طحن طاحونة الكره.ملاحظه: يمكن استخدام ميسليا الطازجة كذلك. عند القيام بذلك ، جفف ميسليا بدقه قدر الإمكان قبل التجمد وتاكد من ان الجرار طحن في النيتروجين السائل لطحن ميسليا الطازجة. طحن ميسليا إلى مسحوق في 25 هرتز ل 30 ثانيه.ملاحظه: في الحالات التي لا توجد فيها اله طحن ، طحن ميسليا إلى مسحوق باستخدام هاون ومدقه ، كما هو موضح من قبل bayram et al. 12-الآن نقل مسحوق ميسيليال إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أماله أنبوب الطرد المركزي بما في ذلك ميسليا الأرض للسماح اللاحقة خلط ميسليا مع العازلة. أضافه 6 مل من الجليد الباردة B250 بما في ذلك 1 × الانزيم البروتيني المثبط كوكتيل لكل غرام من مسحوق ميسيليال ومزيج مع ملعقة صغيره حتى يتم تحقيق التجانس الكامل لاستخراج الخام. عند استخدام mycelia الطازجة ، والرجوع إلى Bayram et al. 12 لتحقيق الكتلة الحيوية الصحيحة لاستخراج نسبه العازلة. الحفاظ علي أنبوب علي الجليد لمده 5 دقائق. وضع أنبوب وأنبوب التوازن في جهاز الطرد المركزي وتدور في 40,000 × ز ل ≥ 20 دقيقه في 4 ° c. تنفيذ تاخيرمن من الراتنج مفتش (الخطوة 2.3) خلال طرد. بعد طرد, أزاله 10 μl من ماده طافي لتحليل SDS-PAGE. وضع العينة في أنبوب 1.5 mL التي تحتوي علي 40 μL من الماء و 12.5 μL من 5 × LSB; يشار اليها باسم “Ex” في الشكل 1. بعناية أزاله ماده طافي (مسح lysate) باستخدام ماصه المصلية ونقلها إلى العمود الذي يحتوي علي الخرز معايرتها مفتش (الخطوة 2.3) ووثيق باحكام باستخدام غطاء نهاية المقدمة. تاخيرمن من الراتنج مفتش (أجريت خلال 2.2.7 الخطوة) اعداد العمود اللوني القابل للتصرف 10 مل و ماصه pipet-x 300 μL من الراتنج جيدا أعاده التعليق مفتش (50 ٪ الطين) في العمود. ملء العمود إلى 10 مل مع B250 والسماح للمخزن المؤقت من خلال الجاذبية. أضافه 1 مل من B250 بما في ذلك 1 × الانزيم البروتيني مثبطات كوكتيل والسماح بالتدفق من خلال. قم بتوصيل الجزء السفلي من العمود. تنقيه دفعه من الحنفية الموسومة HDAC احتضان العمود اللوني الذي يحتوي علي الخرز المعايرتها و محلله مسح من الخطوة 2.2.9 علي خلاط دوار في 10 دوره في الدقيقة في 4 درجه مئوية ل 2-4 h. بعد ربط الدفعة ، قم بازاله الغطاء وافتح العمود في الجزء السفلي لتجميع التدفق. أخذ عينه لتحليل SDS-PAGE كما هو موضح في الخطوة 2.2.8 ؛ يشار اليها باسم “FT” في الشكل 1. غسل الخرز مع 10 مل من WB250. أولا ، استخدم 1 مل من العازلة لأزاله الخرز المحاصرين من غطاء العمود باستخدام pipettor ونقل هذا التعليق في واحده دافق علي الراتنج استقر للسماح أعاده تعليق من الخرز. ثم أملا العمود بالأعلى ، واغلق باستخدام غطاء مكدس وقم بالاتصال بالمضخة التمعجيه. ضبط معدل تدفق حوالي 1 – 5 مل/دقيقه. منع الراتنج من تشغيل الجافة. كرر الخطوة 2.4.4 ثلاث مرات لما مجموعه أربعه يغسل مع WB250. غسل الخرز ثلاث مرات مع 10 مل من TEB كما هو موضح في الخطوة 2.4.4. إغلاق العمود اللوني في الجزء السفلي ، وأعاده التعليق مفتش الخرز في 1 مل من TCB ، وأضافه 20 μl من 50 الانزيم البروتيني المثبطات كوكتيل وكذلك 10 ΜL من tcb (~ 1 ملغ/مل الأسهم ، S219V متحولة البديل المنتجة في المنزل). كاب العمود واحتضان علي خلاط دوار في 10 دوره في الدقيقة في 4 °c ليلا إلى الوت المجمعات البروتين ملزمه عن طريق hdac الموسومة.ملاحظه: بدلا من ذلك اجراء هضم TEV في درجه حرارة مرتفعه (16-25 درجه مئوية) ، مما يقلل من وقت رد الفعل ، ومع ذلك ، هو زيادة خطر تدهور البروتين. في اليوم التالي فتح العمود وجمع الشطف في أنبوب الطرد المركزي 2 مل. استخدام 0.7 mL من TCB لأزاله الخرز من الغطاء وشطف جدار العمود. ضع العمود علي أنبوب 2 مل مفتوحة من الخطوة السابقة التي وضعت نفسها داخل أنبوب الطرد المركزي 50 mL. نقل هذا التجميع إلى اعلي الطرد المركزي الجدول وتدور في 300 × g لمده 2 دقيقه. هذا هو TEV التملص.ملاحظه: عند اجراء تنقيه تقارب ترادفي ، استخدم tev التملص كادخال للخطوة التقارب كالموديولين. يمكنك أيضا تقسيم TEV التملص واستخدام جزء واحد لتحديد النشاط HDAC والجزء الثاني لإكمال تنقيه الحنفية. أزاله 50 μL من TEV التملص وأضافه 12.5 μL من 5 × LSB لصحيفة SDS (المشار اليها باسم “TE” في الشكلين 1 و 2) والحفاظ علي المتبقية علي الجليد. لتقييم فعاليه الانزيم البروتيني ، أضافه 2 مل من 5 ٪ (v/v) حمض الخليك واحتضان في RT لمده 5 دقائق. مره أخرى ، استخدم mL الاولي لأعاده تعليق الراتنج. جمع حمض التملص ومره أخرى تاخذ 50 μL عينه وأضافه 12.5 μL من 5 × LSB (المشار اليها باسم “AE” في الشكل 1). سيتحول LSB إلى اللون الأصفر عند اضافته إلى المحلول الحمضي. لتحييد الحمض ، أضافه 10 م NaOH في خطوات من 1 μL وتخلط جيدا حتى يتغير لون الأزرق مره أخرى. تتوازن الراتنج مفتش مع TBS-T لتحييد الحمض. تخزين الراتنج في TBS-T/20 ٪ (v/v) الايثانول في 4 درجه مئوية لأعاده استخدامها مع نفس الموسومة البروتين. تخزين كسور الشطف Aliquot و شطف في ~ 100 μl الكسور ، لتجنب عده دورات تجميد الذوبان. تجميد قسامات في النيتروجين السائل والحفاظ علي-80 درجه مئوية.ملاحظه: العينات المخزنة بهذه الطريقة ستكون مستقره لعده أشهر دون فقدان النشاط الانزيمي. 3-تحليل التنقية بواسطة صحيفة البيانات الخاصة والغربية التنقيط استخدام البروتوكولات القياسية لصب الهلام polyacrylamide SDS أو استخدام الهلام الجاهزة13. عينات من المقطع السابق في 95 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، والطرد المركزي في ≥ 15,000 × g لمده 5 دقائق ، وتحميل علي الهلام 12 ٪. يتم إعطاء وحدات تخزين التحميل الموصي بها في وسيله إيضاح الشكل 1. الكتروفوريس العينات في 1 × تريس-الجليسين SDS-صفحه تشغيل المخزن المؤقت في 180 V ثابت لمده 60-70 دقيقه ، حتى علامة الأزرق بروموفينول من المخزن المؤقت التحميل الصفحة SDS يبدا في الهجرة من هلام. استخدام البروتوكولات القياسية لتلطيخ الفضة من الهلام. علي سبيل المثال ، استخدم بروتوكول بلوم et al. 198714 التي تتوافق أيضا مع تحليل MS. استخدام البروتوكولات القياسية للغرب التنقيط15. النسبة لتوليد النتائج التمثيلية أدناه ، استخدم نظام التنقيط المتاح تجاريا. المسبار البقع مع المتاحة تجاريا المضادة لل calmodulin ملزمه البروتين (مكافحه الجمارك) الأجسام المضادة في 5 ٪ (w/v) مسحوق الحليب في TBS-T في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.ملاحظه: يتم توجيه المضادة لمنع الانتشار الأضداد ضد جزء من العلامة TAP لا تزال موجودة بعد الانقسام TEV. استخدام البروتوكولات القياسية للكشف عن وتطوير blots. علي سبيل المثال ، تم استخدام المضادة للأرنب الفوسفاتيز المتقارن القلوية و BCIP/NBT الركيزة التنمية اللون لتوليد النتائج التمثيلية أدناه. 4. دياسيتيل الفحص باستخدام في المختبر [3ح] خلات المسمي الدجاج الشبكية الحجاب الحي (مقتبسه من trojer et al. 2003)4 الرجوع إلى بروتوكول Kölle et al. 199816 لاعداد [3ح] خلات المسمية الدجاج شبكيه العين histones. لكل حاله الفحص مكان ثلاثه 1.5 الطرد المركزي mL أنابيب علي الجليد للقياسات في triplicates. أيضا اعداد ثلاثه أنابيب للتحكم في الخلفية العازلة فقط. وضع 25 μL من WB150 في كل أنبوب وأضافه 25 μL من TEV التملص من الخطوة 2.4.11 والحفاظ علي الجليد. سخن الحاضنة أنبوب إلى 25 درجه مئوية. استخدام فترات 15 s (وقف ووتش) لأضافه 10 μL من histones المسمية [1.5 mg/mL] لكل أنبوب. قبل البدء في الفحص ، تناول 10 μL من [3H] خلات الدجاج المسمية histones وبدء ساعة التوقف. بعد خمس ثوان من البداية ، أضف الأحجار الكريمة المسمية ، اغلق الأنبوب باحكام ، دوامه ، ووضعه في الحاضنة. استخدام فترات 15 s لأضافه 10 μL من histones المسمي والمضي قدما كما هو موضح في الخطوة السابقة. بعد 60 الحضانة دقيقه أضافه 50 μL من محلول التوقف (1 م HCl/0.4 M حمض الخليك) لكل أنبوب في فترات 15 s; دوامه فورا. بعد أضافه المحلول الحمضي ، يكون مزيج الفحص مستقرا ويمكن الاحتفاظ به في RT حتى الخطوة التالية. أضافه 800 μL من خلات ايثيل لكل أنبوب لاستخراج المفرج عنهم [3ح] حمض الخليك. إغلاق الأنابيب باحكام ودوامه كل أنبوب ل 5 ليالي. ضع الأنبوب في الطرد المركزي الصغير وتدور في 10,000 × g لمده 10 دقيقه في RT. في هذه الاثناء ، واعداد قنينة واحده تلالؤ لكل عينه الفحص وأضافه 3 مل من كوكتيل التلالؤ للعينات مسعور. بعد طرد (الخطوة 2.12) ، نقل بعناية 600 μL من المرحلة العضوية العليا إلى أنابيب التلالؤ المعدة وإغلاق الأنابيب باحكام. قياس النشاط الإشعاعي المطابق للنشاط HDAC في عداد التلالؤ السائل.

Representative Results

ويرد في الشكل 1 (المشار اليه باسم “مفتش”) النتيجة النموذجية للتخصيب الأحادي الخطوة المقدم من الحاسوب المحمول. ومن أجل الاكتمال ، أدرجنا أيضا كسور التدفق والامتصاص (“تمويل الإرهاب” و “CE”) التي توضح الخطوة الثانية لتنقيه راتنج كاليموولين (“CaM”) علي النحو الموصوف في12. يظهر الهلام الملون باللون الفضي (A) بوضوح فعاليه خطوه التقارب الاولي التي تزداد بشكل أكبر عند اجراء التنقية الترادفية. معظم البروتينات البارزة الموجودة في استخراج البروتين وتدفق من خلال, ومع ذلك, واستنفدت بالفعل في الشطف TEV (TE). من المهم ان نلاحظ ان الكسور TEV الشطف هي > 100 × تتركز بالمقارنة مع استخراج والتدفق من خلال. علامة النجميه الموسومة RpdA (قارن لوحه B). وتبلغ القيمة المحسوبة لل RpdA بما في ذلك المصرف الخاص بالجمارك (RpdA:: الجمارك) 82 دولارا ، ومع ذلك ، يهاجر البروتين بوزن جزيئي ظاهر اعلي بكثير من 120 ده. وقد لوحظت هذه الظاهرة في السابق ويمكن تعيينها للخصائص المحددة لمحطتها الرابعة (ج)4،17. ويظهر المناعي (ب) إشارات قويه تهاجر في حوالي 120 دهت المقابلة لشركات الجمارك الرقمية ذات الطول الكامل لل rpda (rpda:: الجمارك العامة) في الشطف tev (“TE”) ، وتدفق كالموديولين (“تمويل”) ، والتهرب (“CE”) الكسور. في الحامضة [الويت] (“[ا]”) اشاره ثانيه مع [مو] كبيره قليلا مرئية. وهذا يمثل نسبه الحنفية الموسومة RpdA منضمة إلى الراتنج مفتش التي لم تصدر عن طريق الانقسام TEV. يماثل الفرق في حجم إلى 16 [كدا] من البروتين تكرار من [اونكليفيد] [رpda]:: صنبور. وكما هو متوقع ، لا يمكن الكشف عن اي عصابات بواسطة الأجسام المضادة لمكافحه الجمارك في أجزاء التحكم من النوع البري (اللوحة B، “النوع البري”). يتم عرض نتائج اختبار النشاط دياسيتيل ممثل مع مثبط HDAC محدده trichostatin A (TSA) في الشكل 2. وقد وضعت هذه المقايسة أصلا للنباتات18 واستخدمت أيضا للكشف عن المثبطات ضد الثدييات دياسياسيس19,20. ووصفت الأحجار الكريمة المستخدمة لمقايسة واعدت علي النحو الموصوف16. ويظهر اثر زيادة تركيزات TSA علي النشاط الحفاز لمجمع RpdA المخصب (“TE ± TSA”). وتؤكد حساسية النشاط ان القيم المحسوبة لكل الف ظهور بالفعل ترجع إلى RpdA وليس بسبب نشاط الانزيم البروتيني غير المحدد. هذا هو ملاحظه هامه لأنه يشير إلى ان TEV ، والتي هي موجودة في تركيز عاليه بدلا من ذلك ، لا تتداخل مع الفحص النشاط HDAC. [أين وردر تو] عينت يقيس [هداك] نشاط إلى [ركك], استعملت سلاله [بري-مني] كان كتحكم سلبيه (“[ك]”). كما هو متوقع ، تم الكشف عن النشاط HDAC هامشيه فقط (حوالي 5-10 ٪ من الكسور المخصب RpdA) في الشطف TEV من نوع البرية. ومن المثير للاهتمام ، يتم تقليل النشاط HDAC بشكل كبير بعد خطوه تنقيه التقارب الثانية (“CE”) بالمقارنة مع الشطف TEV. الشكل 1 بالتوازي مع تقارب الملحقات من الحنفية-الموسومة RpdA. يتم عرض هلام بولياكرياميد من الفضة الملونة بنسبه 10% (a) واللطخه الغربية التي تم سبرها مع الجسم المضاد لحماية الجمارك ومكافحه ألغام (B). لين وضع العلامات والمجلدات المحملة علي النحو التالي: “M”: 2 μl من 1:10 المخفف علامة البروتين غير الملون (وصمه عار الفضة) ، 3.5 μl من علامة البروتين بريملون (وصمه عار الغربية) ؛ “Ex”: عينه مستخلص البروتين كما أعدت في الخطوة 2.2.8 (2 μلتر من التخفيف 1:10 ، 5 μl) ؛ “FT”: مفتش الراتنج تدفق من خلال عينه كما أعدت في الخطوة 2-4 (2 μلتر من 1:10 التخفيف ، 5 μl) ؛ “AE”: حمض التملص من الخطوة 2.4.14 (10 μl ، 10 μl) ؛ “TE”: TEV التملص من التملص بين عشيه وضحيها عن طريق الانقسام TEV ، خطوه 2.4.12 (10 μl ، 10 μl) ؛ “قدم”: كالموديولين تدفق من خلال (20 μl ، 20 μl) ؛ “CE”: كالمؤولين الشطف (10 μl ، 10 μl). ويشار إلى حجم البروتينات علامة محدده علي الجانب الأيسر من اللوحات. وتتطابق الكميات المعطية بين قوسين مع عينه من الشحنات للبقع الفضية واللطخه الغربية ، علي التوالي. العلامات النجميه في هلام الملونة الفضة تشير إلى بروتين الانصهار RpdA. تم الكشف عن وصمه المناعية (B) مع الفوسفاتيز القلوية باستخدام اللون BCIP/nbt نظام التنمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 2 فحص النشاط HDAC تحت تركيزات متزايدة من trichostatin A. تم اختبار فعاليه تثبيط RpdA مع 25 μL من التقارب-تنقيه المؤتلف RpdA (“TE”) و 25 μL من 0, 10, 50, و 500 nM من المثبط HDAC TSA المخفف في RPDA-1640 المتوسطة. تم استخدام RPMI لتقييم نشاط الخلفية (“فارغه”). يتم عرض أنشطه النهائي بعد الخطوة التقارب كالموديولين الثانية (“CE”) وسلاله غير الموسومة بعد خطوه تنقيه التقارب الاولي (السيطرة السلبية ، “Co”). تظهر الانشطه كنسبه مئوية من RpdA المخصب بدون TSA (100% ، “TE”). تشير أشرطه الخطا إلى الانحراف المعياري لثلاث نسخ متماثلة. وقد تم تعديل هذا الرقم من باور وآخرون 20162. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يصف هذا البروتوكول إثراء خطوه واحده من فئة الحنفية الموسومة 1 hdac من الفطريات الخيطية ا. معشش لتقييم النشاط deاسيتيل المختبر. تم تقديم العلامة TAP في الأصل في الخميرة بيكر لتحديد شركاء التفاعل بروتين البروتين من البروتين الموسومة6. في وقت لاحق ، كانت العلامة codon-الأمثل لاستخدامه في ا. معشش5. هنا نقدم بروتوكول خطوه بخطوه علي التوالي لتطبيق خطوه تنقيه التقارب الاولي من استراتيجية TAP لإثراء خطوه واحده من الفئة 1 HDAC المساعد الشخصي الرقمي. خطوه تنقيه التقارب الثانية بوضوح يزيد من مستوي تنقيه ، وهو أمر مهم بشكل خاص لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع الطعم. ومع ذلك ، فان الخطوة الاولي فقط موصي بها لاختبار النشاط اللاحق ، حيث ان عدم وجود تلوث كبير بعد الخطوة الاولي أكدته تجربه مراقبه باستخدام سلاله من النوع البري. وعلاوة علي ذلك ، فان النشاط الذي لا يمكن التملص منه يكون اعلي بكثير بعد التخصيب بخطوه واحده بالمقارنة مع النقرة الكاملة. بالاضافه إلى RpdA2, وقد استخدم هذا البروتوكول أيضا بنجاح لتنقيه ا. نيدولانز المجمعات من الدرجة الثانية 1 hdac هوا21.

بسبب ملاحظاتنا ان الطبقة الفطرية 1 HDACs بناء مجمعات مستقره4، لقد نجحنا في تعديل البروتوكول بواسطة bayram et al. 201212 التي تمثل أساس هذه الطريقة. ومع ذلك ، لا بد من ذكر بعض الخطوات الحاسمة. يعد اعداد مستخلصات البروتين عاليه التركيز لضمان الظروف شبه الفسيولوجية أمرا حاسما للاستقرار المعقد. ولذلك ، من المهم النظر في التوصيات المقدمة بشان النسبة العازلة للكتلة الاحيائيه/الاستخراج. في هذا الصدد ، من المهم أيضا استخدام مساحيق الطحن الجيدة لضمان الاستخراج السليم. هنا ، واستخدام اله طحن من المفيد بشكل واضح. كما ذكر في قسم البروتوكول ، فانه من الجدير محاولة الخطوة TEV الانقسام ل 1-2 h في درجه حرارة الغرفة من أجل تسريع تنقيه. وقد اختبر هذا الأمر بالنسبة لل RpdA دون ملاحظه اي اثار ضاره علي الاستقرار (المراقبة غير المنشورة ، باور الأول ، 2018). الاضافه إلى ذلك ، استبدال NP40 (المستخدمة في البروتوكول الأصلي) مع TX-100 قد لا تكون مناسبه لمجمعات البروتين الأخرى. عند استخدام هذه الطريقة لتنقيه البروتينات الأخرى التي تحمل علامات اللمس ، ينبغي للمرء ان يشير أيضا إلى بروتوكول Bayram ، الذي يحتوي علي عدد من التلميحات القيمة التي قد تكون مفيده لتنقيه كافيه من المجمعات البروتينية الأخرى12.

وبالاضافه إلى هنا وصف الحنفية الطريقة ، والعلامات التقارب الأخرى والتقنيات تستخدم عاده لإثراء خطوه واحده من البروتين من الفطريات الخيطية ، بما في ذلك له-و GFP-العلامات. ومع ذلك ، كما الطبقة 1 HDACs عموما وظيفية كمجمعات عاليه الوزن الجزيئي ، وشروط الامتصاص الاصليه هي شرط أساسي لإثراء HDACs نشطه محفزه. الأهم من ذلك ، يتم تنفيذ العديد من التكبير التقارب الأخرى في ظل ظروف غير مواتيه. علي سبيل المثال ، إثراء HDACs عن طريق GFP فخ ، والذي يستند إلى التفاعل مستضد الأجسام المضادة ، ليست مناسبه بسبب ظروف الامتصاص الحمضية تتداخل مع التفاعل بروتين البروتين من المجمعات HDACS منضمة إلى الراتنجات. وعلاوة علي ذلك, محاولات لتنقيه RpdA له الموسومة بواسطة اللونية التقارب مخلب المعادن22, أسفرت عن خسارة كبيره من النشاط الحفاز خلال عمليه تنقيه علي الرغم من ان ايميدازول بدلا من الشروط المنخفضة الحموضة وقد استخدمت لل التملص ( بيانات غير منشوره ، باور ، I ، 2010).

واحده يحد من ال يوصف انزيميه فحص بروتوكول الاستعمال من الركيزة إشعاعيه. ومع ذلك ، تم تطوير المقايسات علي أساس الفلورسنت أيضا23و24 ومتاحه تجاريا. يتم تنفيذ هذه المقايسات في لوحات جيدا ، التالي هي مناسبه أيضا لفحص عاليه الانتاجيه من مثبطات HDAC. وفي هذه الحالة ، يلزم القيام بإجراءات راقيه للإجراءات المعروضة.

وتشمل التطبيقات المحتملة المقبلة لهذا البروتوكول إثراء المجمعات الفرعية المحددة من الفئة 1 HDACs لتقييم أدوارهم الفسيولوجية المحددة و/أو الاختلافات في قابليتها لمثبطات HDACS. عند إنشاء الطريقة الموصوفة لانزيمات أخرى ، يوصي بشده باجراء تجربه تحكم سلبيه بسلاله غير موسومة. وهذا يضمن خصوصية أنشطه الانزيم المقاسه ويكشف عن التلوث بالانزيمات المرتبطة بشكل غير محدد.

تنقيه والنشاط المقايسة الموصوفة هنا يمكن ان يؤديها في غضون يومين والانزيمات المخصب مستقره لعده أشهر علي الأقل ، عند تخزينها في قسامات في-80 درجه مئوية. وفي الختام ، يوفر هذا البروتوكول طريقه بسيطه نسبيا وفعاله من حيث التكلفة لتحقيق الفئة 1 HDAC المجمعات لقياس النشاط وتحديد فعاليه المثبط.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونود ان نشكر بترا مرشاك ، شعبه البيولوجيا الجزيئية (بيوانتر ، جامعه انسبروك الطبية) ، علي مساعدتها ودعمها فيما يتعلق بهذه المخطوطة. الاضافه إلى ذلك ، نود ان نشكر المستعرضين علي تعليقاتهم القيمة.

تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق العلوم النمساوي (P24803 إلى SG و P21087 إلى GB) ومن خلال التمويل الداخل (MUI Start, ST201405031 إلى IB).

Materials

10 x SDS-PAGE running buffer Novex
2-mercaptoethanol (EtSH) Roth 4227
25 cm2 cell culture flasks with vent cap Sarstedt 833910002 For spore production
47 mm vacuum filtration unit Roth EYA7.1
AccuFLEX LSC-8000 HITACHI – Scintillation counter
Acetic acid Roth 7332
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody Millipore 07-482 Used at 1:1333 dilution
Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody Sigma-Aldrich A3687
Ball mill Retsch 207450001 Mixer Mill MM 400
BCIP/NBT Promega S3771 Color development substrate for AP
Cell strainer Greiner 542040
Cheese cloth for harvesting mycelia BioRen H0028 Topfentuch
Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth 4720
EDTA Prolabo 20309.296
Ethyl acetate Scharlau Ac0155
Freeze Dryer LABCONCO 7400030 FreeZone Triad
Glycerol Roth 3783
HCl Roth 4625
IgG resin GE Healthcare 17-0969-01 IgG Sepharose 6 Fast Flow
Inoculation loops VWR 612-2498
KOH Merck 5033
Laminar flow cabinet Thermo Scientific – Hera Safe KS
Mixed Cellulose Esters Membrane Filters Millipore GSWP04700
NaCl Roth 3957
NaOH Roth 6771
Neubauer counting chamber improved Roth T728
Novex gel system Thermo Scientific For SDS-PAGE
Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) Thermo Scientific LC2675 Running buffer for SDS-PAGE
peqGold protein-marker II VWR 27-2010P Protein ladder used for silver stain
Peristaltic Pump P-1 GE Healthcare 18111091
Pipette controller Brand 26302 accu-jet pro
Poly-Prep chromatography columns Bio-Rad 731-1550
ProSieve QuadColor protein marker Biozym 193837 Prestained protein ladder used for western blot
Protease inhibitor cocktail tablets Sigma-Aldrich 11873580001 cOmplete, EDTA-free
Rotary mixer ELMI – Intelli-Mixer RM-2 S
Rotiszint eco plus Roth 0016
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
Scintillation vials Greiner 619080
Sorvall Lynx 4000 Thermo Scientific
Thermomixer comfort Eppendorf
TIB32.1 A. nidulans rpdA::TAP strain.
Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1;
argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad 1704271
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad 1704150
Trichostatin A (TSA) Sigma-Aldrich T8552 5 mM stock in DMSO
Tris (free base) Serva 37190
Tris-HCl Roth 9090
Polysorbate 20 Roth 9127 Tween 20
Polysorbate 80 Sigma-Aldrich P1754 Tween 80
TX-100 Acros Organics 215682500 Triton X-100, Octoxynol-9 detergent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Gregoretti, I. V., Lee, Y. -. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. Journal of Molecular Biology. 338 (1), 17-31 (2004).
  2. Bauer, I., et al. A Class 1 Histone Deacetylase with Potential as an Antifungal Target. mBio. 7 (6), (2016).
  3. Stefan, A., et al. Purification of active recombinant human histone deacetylase 1 (HDAC1) overexpressed in Escherichia coli. Biotechnology Letters. 40 (9-10), 1355-1363 (2018).
  4. Trojer, P., et al. Histone deacetylases in fungi: novel members, new facts. Nucleic Acids Research. 31 (14), 3971-3981 (2003).
  5. Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., et al. VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism. Science. 320 (5882), 1504-1506 (2008).
  6. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  7. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  8. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48, (2001).
  9. Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
  10. Zadra, I., Abt, B., Parson, W., Haas, H. xylP promoter-based expression system and its use for antisense downregulation of the Penicillium chrysogenum nitrogen regulator NRE. Applied and Environmental Microbiology. 66 (11), 4810-4816 (2000).
  11. Stolz, D. J., et al. Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  12. Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., et al. Identification of protein complexes from filamentous fungi with tandem affinity purification. Methods in Molecular Biology. 944, 191-205 (2012).
  13. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  14. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
  15. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
  16. Kölle, D., et al. Biochemical methods for analysis of histone deacetylases. Methods. 15 (4), 323-331 (1998).
  17. Tribus, M., et al. A novel motif in fungal class 1 histone deacetylases is essential for growth and development of Aspergillus. Molecular Biology of the Cell. 21 (2), 345-353 (2010).
  18. Sendra, R., Rodrigo, I., Salvador, M. L., Franco, L. Characterization of pea histone deacetylases. Plant Molecular Biology. 11 (6), 857-866 (1988).
  19. Valente, S., et al. 1,3,4-Oxadiazole-containing histone deacetylase inhibitors: anticancer activities in cancer cells. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (14), 6259-6265 (2014).
  20. Mai, A., et al. Synthesis and biological properties of novel, uracil-containing histone deacetylase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (20), 6046-6056 (2006).
  21. Pidroni, A., et al. A Class 1 Histone Deacetylase as Major Regulator of Secondary Metabolite Production in Aspergillus nidulans. Frontiers in Microbiology. 9, 2212 (2018).
  22. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
  23. Wegener, D., Wirsching, F., Riester, D., Schwienhorst, A. A fluorogenic histone deacetylase assay well suited for high-throughput activity screening. Chemistry & Biology. 10 (1), 61-68 (2003).
  24. Peng, L., Yuan, Z., Seto, E. Histone deacetylase activity assay. Methods in Molecular Biology. 1288, 95-108 (2015).

Tags

TAP-taggedHistone DeacetylaseAspergillus NidulansEnzymatic Activity AssayClass 1 Histone DeacetylasesRpdAFungal InfectionsHDAC ComplexesFungal-specific Deacetylase InhibitorsConidiaMyceliaLyophilizationBall MillExtraction Buffer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Bauer, I., Pidroni, A., Bayram, Ö., Brosch, G., Graessle, S. Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay. J. Vis. Exp. (147), e59527, doi:10.3791/59527 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image