Mejorar el injerto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre a través de una inhibición transitoria de la actividad de Rho Kinase
Summary
En este protocolo, demostramos y profundizamos en cómo utilizar células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la diferenciación y purificación de cardiomiocitos, y más adelante, sobre cómo mejorar su eficiencia de trasplante con inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho pretratamiento en un modelo de infarto de miocardio de ratón.
Abstract
Un factor crucial en la mejora de la eficacia de la terapia celular para la regeneración miocárdica es aumentar de forma segura y eficiente la tasa de injerto celular. Y-27632 es un inhibidor muy potente de Rho-asociado, bobina enrollada-que contiene proteína quinasa (RhoA/ROCK) y se utiliza para prevenir la disociación inducida por la apoptosis celular (anoikis). Demostramos que el pretratamiento Y-27632 para cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (hiPSC-MC+RI)antes de la implantación da como resultado una mejora de la tasa de injerto celular en un modelo de ratón de infarto agudo de miocardio (MI). Aquí, describimos un procedimiento completo de diferenciación hiPSC-CM, purificación y pretratamiento celular con Y-27632, así como la contracción celular resultante, mediciones transitorias de calcio y trasplante en modelos MI de ratón. El método propuesto proporciona un método simple, seguro, eficaz y de bajo costo que aumenta significativamente la tasa de injerto celular. Este método no sólo puede utilizarse junto con otros métodos para mejorar aún más la eficiencia del trasplante de células, sino que también proporciona una base favorable para el estudio de los mecanismos de otras enfermedades cardíacas.
Introduction
Las terapias basadas en células madre han demostrado un potencial considerable como tratamiento para el daño cardíaco causado por MI1. El uso de hiPSC diferenciados proporciona una fuente inagotable de hiPSC-CP2 y abre la puerta al rápido desarrollo de tratamientos innovadores. Sin embargo, siguen existiendo muchas limitaciones a la traducción terapéutica, incluido el desafío de la tasa de injerto severamente baja de las células implantadas.
La disociación de células con trippsina inicia anoikis3, que sólo se acelera una vez que estas células se inyectan en ambientes hostiles como el miocardio isquémico, donde el ambiente hipóxico acelera el curso hacia la muerte celular. De las células restantes, una gran proporción se lava desde el sitio de implantación en el torrente sanguíneo y se extiende por toda la periferia. Una de las vías apoptoticas clave es la vía RhoA/ROCK4. Basado en investigaciones previas, la vía RhoA/ROCK regula la organización citoesquelética actina5,6, que es responsable de la disfunción celular7,8. El inhibidor DE ROCK Y-27632 es ampliamente utilizado durante la disociación somática y de célulasmadre y el passaging, para aumentar la adhesión celular y reducir la apoptosis celular 9,10,11. En este estudio, Y-27632 se utiliza para tratar hiPSC-CM antes del trasplante en un intento de aumentar la tasa de injerto celular.
Se han establecido varios métodos destinados a mejorar la tasa de injerto celular, como el choque térmico y el recubrimiento de matriz de membrana de sótano12. Aparte de estos métodos, la tecnología genética también puede promover la proliferación de cardiomiocitos13 o revertir las células no miocárdicas en cardiomiocitos14. Desde la perspectiva de la bioingeniería, los cardiomiocitos se asintan en un andamio biomaterial para mejorar la eficiencia del trasplante15. Desafortunadamente, la mayoría de estos métodos son complicados y costosos. Por el contrario, el método propuesto aquí es simple, rentable y eficaz, y se puede utilizar como tratamiento basal antes del trasplante, así como en conjugación con otras tecnologías.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos clave de este estudio incluyen la obtención de hiPSC-CM puros, la mejora de la actividad de los hiPSC-CM a través del pretratamiento Y-27632 y, por último, el trasplante de una cantidad precisa de hiPSC-CM en un modelo de MI de ratón.
Las cuestiones clave que se abordaron aquí fueron que, en primer lugar, optimizamos los métodos de purificación sin glucosa19 y establecimos un novedoso sistema de purificación eficiente. El procedimiento del sistema incl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. Joseph C. Wu (Universidad de Stanford) por proporcionar amablemente la construcción Fluc-GFP y al Dr. Yanwen Liu por su excelente asistencia técnica. Este estudio cuenta con el apoyo de las becas HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (a J.Z.), y HL121206A1 (a L.Z.), y una beca R56 HL142627 (a W.Z.), una Asociación Americana de Desarrollo del Corazón, una Beca de Desarrollo del Corazón 16SDG30410018, y la Universidad de Alabama en Birmingham Faculty Development Grant (a W.Z.).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
Riferimenti
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