神経疾患におけるリピドミクスとトランスクリプトミクス

近年の脂質の機能の進歩と神経疾患の発症・進行における脂質の役割は、新たな治療標的や疾患メカニズム解明の新たな研究開発の場を切り拓いています¹。質量分析イメージングや高度な質量分析プロファイリングなどの現代の分子イメージング技術によって強調された、異なる脳領域における脂質組成の文書化された違いは、脂質調査のパラダイムを全脳から機能的に別個の脳領域へとシフトさせる。脂質組成が異なる脳領域で変化するという事実は、機能的に異なる脳領域にわたる脳の侮辱または刺激に応答して、膜脂質感受性および下流脂質シグナル伝達の両方の新しい概念化を促す。したがって、脂質プロトコルは、より高い空間分解能の検出および定量化のための低組織量の課題に対処するための新しい開発を必要とし、同時に、細胞膜およびシグナル伝達経路の複数の脂質成分の分析を必要とする。また、それらのレベルおよび機能の調節に関与する酵素、脂質リガンド、および受容体の決定は、神経学的疾患において影響を受けるシグナル伝達経路を解明し、病態生理学的文脈における新しい機構的研究を導くために最も重要である。

脳の空間分解能の向上に加えて、新しい神経リピドミーアプローチの開発に挑戦する2つの大きな困難があります。第1に、脂質シグナル伝達分子は、典型的には、膜構成脂質と比較して非常に低い存在量のものである。第2に、リピドームは高い構造的不均一性を示し、単一の分析アプローチを用いて解剖することは困難である。したがって、抽出および分析方法は、異なる脂質カテゴリーに合わせて調整され、異なる組織サンプルで一般的に実行されます。².ショットガンリピドミクス法³ 膜脂質の広範なプロファイルを迅速に明らかにするための優れたツールであり、標的化された発見および定量化質量分析法によってもたらされる感度および選択性の増加は、i)炎症性脂質およびii)エンドカンナビノイド(eCB)、アミノ酸結合脂質などのニューロン活性の調節に関与する脂質を含む、低豊富シグナル伝達脂質の調査に利用され、 等。^4,5.神経学的疾患モデルの脳領域において生じる細胞膜およびシグナル伝達レベルの両方における脂質変化を包含するために、典型的には、脂質抽出および分析は、別個の組織試料において、別個の動物バッチから、または異なる半球から得られ、またはより大きな組織領域を複数の断片に解剖することによって行われる。酵素受容体のmRNAレベルも興味深い場合、それらの調査は通常、別個の組織サンプルの調達を必要とする。例えば、膜脂質、内因性カンナビノイド、およびmRNAの調査には、3つの異なる組織サンプル(例えば、2つの脂質抽出方法(膜脂質およびシグナル伝達脂質)のための2つのサンプル、およびその後の2つの脂質分析方法およびmRNA分析のための1つのサンプル)が必要である。炎症性脂質および内因性カンナビノイドの調査には、それぞれ2つの異なる組織サンプル、抽出方法、および分析方法が必要です。別の例は、脳パンチまたはレーザー微小解剖サンプル中のmRNAおよび脂質カテゴリーの調査であり、その結果、脳(サブ)領域ごとに2つのサンプルを調達するために2つの異なる動物が必要である。このような場合、結果の実質的な程度の変動性および/または再現性の悪さが、生物学的変動性および/または組織の不均一性に起因することが多い。特に脳内で高い空間分解能で起こる多分子分析のこれらの実用的な限界に導かれて、1)LC/MRMによる炎症性脂質(例えば、エイコサノイド(eiCs))およびeCBなどのニューロン活動の調節に関与する脂質の共抽出および共分析を含む3モジュールのニューロリピドミクスプロトコルが設計されました。²;2)リン脂質(PL)とeCBの共抽出とその後のマルチスキャンLC/MRMおよび前駆体/中性損失スキャン分析²;3)膜(リン)脂質およびeCBならびにmRNAの二重抽出、その後のLC/MRMおよびqPCRまたはRNAシーケンシング分析⁶.神経学的疾患および関心のある脳領域において対処されるべき生物学的問題に応じて、第1および第2のプロトコル、または第1および第3のプロトコルの組み合わせを、約4mgの重さの組織について同じ組織標本に適用することができる。第1および第3のプロトコールは、2mg前後の組織に対して独立して適用することができる。第2のプロトコルは、わずか0.5mgの重さの組織に適用することができる。選択された神経リピドームプロトコルモジュールに関係なく、組織サンプリングおよび前分析処理、脳単離および領域解剖、ならびに動物モデルを犠牲にする手順は、プロトコルの3つのモジュールすべてについて標準化され、同一である。神経学的疾患の調査では、疾患の病理学的結果に関連する末梢器官も常に収集され、これらのモジュラープロトコルを使用して分析されます。さらに、血漿リピドミクスのために血液が定期的にサンプリングされ、将来の翻訳アプリケーションの観点から神経学的疾患の読み出しツールとして機能します。ここで提示されたモジュラーリピドミクスプロトコルは非常に汎用性が高く、より大きな組織量に拡張可能であり、事実上あらゆる組織タイプおよび疾患に容易に適用可能である。モジュラープロトコル(図1)神経学的疾患において、外傷性脳損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはてんかんなどの神経学的障害の発症および進行の任意の標準化されたげっ歯類モデルが許容される。

これらのプロトコルは、ヒト側頭葉てんかん(TLE)8,9,10,11に類似しているため、前臨床試験で広く使用されているてんかんのカイニン酸(KA)誘導マウスモデルにおけるてんかんの急性期における組織リピドームおよび/またはトランスクリプトームの変化の研究に広く適用されている^2,7。これらのプロトコールを用いて、パルミトイルエタノールアミド(PEA)^12,13などの薬物の治療可能性を、てんかんの同じマウスモデルにおいて評価した。この研究では、脳および末梢における高分解能および低空間分解能での脂質およびmRNAの変化、最大急性発作強度の時点(発作誘発後60分)、およびKA発作誘発後の4つの異なる時点(20分、60分、120分、および180分)におけるPEAによる亜慢性および急性治療時、てんかんの急性期をカバーする時間窓が同定された。未処理のKA注射マウス、急性および亜慢性PEA処置マウス、ならびにビヒクルおよびPEAビヒクル対照マウスの血漿、脳、および末梢器官を、各時点で収集し^12、13、およびこの分子分析を用いて調査した。分子データは、急性てんかん期の進行およびそれを緩和するPEAの可能性を解明するために、発作スコアリングによって得られた行動表現型、ならびに神経変性プロセスに関する免疫組織化学由来のデータと相関していた。