Метод, свободный от ферментов для изоляции и расширения человеческих адипосальных стволовых клеток

Использование образцов липоаспиратии и абдоминопластики было одобрено Институциональным наблюдательным советом (IRB) Ратгерского университета – Кампус Ньюарк. 1. Подготовка Ткань культуры СМИ Стерильно подготовить 500 мл тканевой культуры средств массовой информации до изоляции ASCs. Чтобы подготовить средства массовой информации культуры, добавить 10% определены плода икроножной сыворотки (FCS) и пенициллина-стрептомицина (10000 U/100 мл) к dulbecco минимальные основные средства массовой информации (DMEM) с высоким содержанием глюкозы и 2 мм L-глутамамин. Носители могут храниться при температуре 4 градусов по Цельсию в течение 3 недель и всегда должны использоваться в тепле (от комнатной температуры до 37 градусов По Цельсию). Если различные средства массовой информации предпочтительнее для культуры стволовых клеток, подготовить, что средства массовой информации, а не. 2. Изоляция АСК от жировой ткани Получить липоаспираты или абдоминопластика образца (ы). После одобрения IRB, получить такие образцы, как отбросить ткани после различных хирургических процедур. Транспорт липоаспираты в лабораторию в каком сосуде хирург удалил ткани; транспортировать образцы абдоминопластики в сумке или контейнере операционной. Храните образец (ы) при комнатной температуре до 6 ч или при температуре 4 градусов по Цельсию на срок до 24 ч, если не обрабатывать немедленно. Образцы тканей, обработанные за пределами вышеупомянутого времени, скорее всего, будут иметь пониженный выход клеток. Держите образцы абдоминопластики влажными путем добавления 1x стерильных фосфатов буферного солей. С этого момента, проводить все шаги в ламинарный поток капот в асептических условиях. Носите перчатки для личной защиты. Держите 10% отбеливатель, 70% этанола, и бумажные полотенца поблизости, чтобы быстро очистить любые биологические разливы. Утилизировать любые избыточные ткани в качестве биомедицинских отходов. Фарш образцы в Злт; 1 мм штук. Если блок абдоминопластики слишком велик, чтобы работать с, вырежьте управляемый размер ткани от блока до измельчения. Перенесите ткань абдоминопластики на крышку стерильной 100-мм пластины. Используйте стерильную иглу, чтобы держать кусок ткани на месте и использовать стерильный скальпель, чтобы фарш куски покинуть либо резки или мягко измельчения от объемной ткани. Этот шаг, как правило, не требуется для липоаспират. Однако, если большие куски ткани наблюдаются в липоаспирати, удалить такие куски с стерильными щипцы и процесс, как указано выше. Перенесите ткань в свежую трубку и инвертировать или встряхнуть образец 5-6 раз, чтобы обеспечить смешивание всех слоев. Дополнительно: если липоаспират и полностью оседлал, удалите и отбросьте слой масла перед смешиванием. Передача 2,5-5 мл ткани в 100 мм вакуумно-газовой плазмы обработанной ткани культурной пластины(Таблица материалов). Измерьте объем образца, наливая в свежую центрифужную трубку. При необходимости используйте стерильный шпатель для передачи ткани. Добавьте в тарелку эквивалентный объем тканевой культуры. Аккуратно закружайте тарелку, чтобы смешать содержимое. Инкубировать паштеты при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 до тех пор, пока достаточное количество клеток не будет видно на основании пластины. Со временем клетки будут мигрировать из ткани на поверхность пластины, после чего они будут придерживаться пластика. Когда они выходят из ткани, клетки будут появляться как небольшие скопления вокруг частей ткани. Каждые 24 ч, удалить как можно больше жидкости, как это возможно, и заменить с аналогичным количеством носителей. Оставьте части ткани на месте, если это возможно. После того, как достаточное количество клеток отмечены на пластине (No gt;10 кластеров из 15-25 клеток на пластине) или после 7 дней, в зависимости от того, что раньше, удалить все оставшиеся части ткани. Культура ASCs в средствах культуры ткани до тех пор пока они не достигнуть 70% confluency или до тех пор пока кластеры не стать плотными (nogt;5 плотные скопления клеток на плите, каждое с диаметром приблизительно йgt; 500 мкм), на котором этап клетки должны быть проходимы. 3 Культура АСК Прохождение ASCs, когда родительская пластина достигает примерно 70% выпуклости. Позаботьтесь о том, чтобы избежать чрезмерной слоячины культур ASC. Аккуратно промыть пластину 1x фосфат буферизированных сольников и trypsinize адептов клеток. Чтобы попробовать клетки, аспирировать фосфат буферного солина и добавить 1 мл трипсина с 0,25% EDTA к каждой пластине и инкубировать при 37 кс в течение 5 мин. После 5 минут, подтвердить де-присоединения с помощью микроскопии. Если клетки все еще придерживаются, верните клетки в инкубатор еще на 5 мин. Добавьте небольшое количество носителей (примерно 25% от общего объема трипсина) к пластине, чтобы отключить трипсин, и осторожно промыть основание пластины с помощью носителя / трипсина. Чтобы вымыть тарелку, держите пластину под небольшим углом и аккуратно пипетка сми / трипсин из верхней части пластины вниз, ослабление любых еженедельных прикрепленных клеток из пластины. Клетки могут быть повторно покрыты в соотношении 1:3 или посеяны при плотности 120 000-500 000 клеток на тарелку. Если посев на основе количества клеток, передача трипсина / медиа из пластины в конической центрифуги трубки, и гранулы клетки центрифугирования на 300 х г в течение 7 мин. Resuspend клетки в ткани культуры средств (примерно 1 мл на начальную пластину) и рассчитывать клетки до посева. Чтобы подсчитать клетки, перенесите 10 qL суспензии клетки в гемоцитометр и посчитайте клетки, присутствующие в 4 х 4 квадранте в каждом углу сетки. Усреднение этих значений вместе и умножить значение на 104 для расчета числа ячеек. Добавить носители в тарелку до посева клеток. Добавить клетки в dropwise образом, а затем закружить пластины для обеспечения равномерного распределения по всей пластине.ПРИМЕЧАНИЕ: После 3 проходов, клетки адепта должны казаться асимметричными и шпинделями формы. ASC фенотип и поведение может быть подтверждено с помощью цитометрии потока и дифференциации анализов. Подтверждение фенотипа и поведения ASC с использованием цитометрии потока и анализа дифференциации Цитометрия потока Соберите и гранулы клетки, как описано выше. Вымойте гранулы с 1x фосфат буферных сольник и этикетки клеток с производителем рекомендуемых объемов антител. Подробный протокол для потока цитометрии, общая лабораторная процедура, можно найти здесь12,14,15. Выберите поверхностные маркерные панели из следующих, чтобы подтвердить фенотип ASC: отрицательный для CD14, CD31, CD34, CD45 и CD106; и положительный для CD29, CD36, CD44, CD73, CD90, и CD10516,17,18,19. Наличие CD36 и отсутствие CD106 различить ASCs от костного мозга полученных MSCs20. Анализы дифференциации: Подтвердите дифференциацию многолинейного возраста с помощью набора дифференциации MSC. Комплекты доступны от нескольких производителей для подтверждения адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференциации потенциала. Изменяйте комплектное средства массовой информации каждые 3–4 дня в рамках протоколов производителя в течение 3 недель или до тех пор, пока не будет наблюдаться морфологическая дифференциация. Культура клеток для нескольких проходов; количество необходимых проходов будет зависеть от приложения(ы). При каждом прохождении подтверждайте морфологию и фенотип клеток MSC с помощью вышеупомянутых маркеров поверхности клеток и убедитесь, что способность дифференциации многолинейного не утеряна. Хотя потенциал расширения отличается между донорами, большинство образцов может быть расширено до 6-9 проходов. Криоконсервайте клетки и храните в жидком азоте для использования в будущем. 4 Криоконсервация АСК Приготовьте 10 мл замораживающих растворов А и В. Для замораживания раствора А добавьте 20% FCS в DMEM с высоким содержанием глюкозы. Для замораживания раствора B добавьте 20% FCS и 20% диметилсульфид (DMSO) в DMEM с высоким содержанием глюкозы. Пелле клетки центрифугирование на 300 х г в течение 5 мин. Resuspend клеток в небольшом объеме замораживания раствора А и рассчитывать клетки с помощью гемоцитометра, как в шаге 3.3.1. Рассчитайте окончательный объем, в который клетки будут переложены, чтобы достичь конечной концентрации клеток в 500 000–1 000 клеток/мл. Используйте замораживание раствора А, чтобы повторно приостановить гранулы в 50% от этого конечного объема. Медленно добавьте равный объем замораживания раствора B dropwise, а агитации трубки для достижения конечной концентрации клеток. Немедленно замораживать клетки в 1-2 мл криовиалов. Заморозить криовиалы в морозильной камере с контролируемой скоростью или в замораживании контейнера, помещенного при -80 градусов по Цельсию, что снижает температуру на 1 градус по Цельсию/мин. После контролируемого замораживания (ночь для замораживания контейнера), передача клеток жидкого азота для длительного хранения.