인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

Lipoaspirate 및 복부 성형술 샘플의 사용은 러트 거스 대학의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다 – 뉴 어크 캠퍼스. 1. 조직배양배지의준비 ASC를 분리하기 전에 500 mL의 조직 배양 배지를 멸균하여 준비합니다. 배양 배지를 준비하려면, 높은 포도당과 2 mML-글루타민을 가진 덜베코의 최소한의 필수 배지(DMEM)에 10% 정의된 태아 송아지 혈청(FCS)과 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/100 mL)을 추가합니다. 매체는 최대 3 주 동안 4 °C에서 보관 할 수 있으며 항상 따뜻하게 사용해야합니다 (실온에서 37 °C 사이). 다른 배지가 줄기 세포의 배양에 바람직한 경우, 대신 그 배지를 준비한다. 2. 지방 조직에서 ASC의 격리 리포아스해적 또는 복부 성형술 샘플을 얻습니다. IRB 승인 후, 다양한 수술 절차에 따라 조직을 폐기와 같은 샘플을 얻을. 외과 의사가 조직을 제거 한 혈관 중 실험실로 lipoaspirates를 수송; 수술실 시편 가방 또는 용기에 복부 성형술 샘플을 운반. 시료를 실온에서 최대 6시간 또는 4°C에서 즉시 처리하지 않을 경우 최대 24시간 동안 보관하십시오. 전술한 시간을 넘어 처리된 조직 샘플은 세포 수율이 감소할 가능성이 있다. 1x 멸균 인산염 완충 식염수를 첨가하여 복부 성형술 샘플을 촉촉하게 유지하십시오. 이 시점부터 무균 조건하에서 층류 후드의 모든 단계를 수행하십시오. 개인 보호를 위해 장갑을 착용하십시오. 10% 표백제, 70% 에탄올, 종이 타월을 근처에 보관하여 생물학적 유출을 신속하게 정리하십시오. 과잉 조직을 생물 의학 폐기물로 폐기합니다. 샘플을 1mm 조각으로 잘라내십시오. 복부 성형술 블록이 너무 커서 작업할 수 없는 경우, 다진 전에 블록에서 조직의 관리 가능한 크기를 잘라냅니다. 멸균 100mm 플레이트의 뚜껑에 복부 성형술 조직을 옮김을 옮김. 멸균 바늘을 사용하여 조직의 조각을 제자리에 고정하고 멸균 메스를 사용하여 벌크 조직을 자르거나 부드럽게 파쇄하여 조각을 잘라냅니다. 이 단계는 일반적으로 lipoaspirates에 대 한 필요 하지 않습니다. 그러나, 큰 조직 덩어리가 lipoaspirate에서 관찰되는 경우에, 위와 같이 멸균 집게로 그 같은 덩어리를 제거하고 프로세스. 조직을 신선한 튜브로 옮기고 샘플을 5-6회 반전또는 흔들어 모든 층의 혼합을 보장합니다. 선택 사항: 리포아흡이 완전히 가라앉은 경우, 혼합하기 전에 오일 층을 제거하고 폐기하십시오. 2.5-5 mL의 조직을 100 mm 진공 가스 플라즈마 처리 조직 배양 판으로 옮김(표오브 머티리얼)으로옮니다. 신선한 원심분리기 튜브에 부어 시료의 부피를 측정합니다. 필요한 경우 멸균 주걱을 사용하여 조직 전달을 돕습니다. 플레이트에 동등한 부피의 조직 배양 배지를 추가합니다. 접시를 부드럽게 돌리면서 내용물과 섞습니다. 충분한 수의 세포가 플레이트의 기저부에서 보일 때까지 5%CO2에서 37°C에서 파테를 배양한다. 시간이 지남에 따라 세포는 조직 내에서 플레이트 표면으로 이동하여 플라스틱에 부착됩니다. 그(것)들이 조직을 종료하는 때, 세포는 조직 조각의 주위에 작은 클러스터로 나타납니다. 매 24 시간마다 가능한 한 많은 액체를 제거하고 비슷한 양의 매체로 교체하십시오. 가능하면 티슈 조각을 제자리에 두십시오. 충분한 수의 세포가 플레이트에 기록되면 (>10 클러스터의 > 15-25 세포가 접시에 있음) 또는 7 일 후, 더 빨리, 조직의 나머지 조각을 모두 제거하십시오. 조직 배양 배지에서 ASC를 70% 합의에 도달할 때까지 또는 클러스터가 조밀해질 때까지 배양합니다(>5 조밀한 세포 군집, 각각 약 > 500 μm의 직경을 가진 세포군재)이 통과되어야 합니다. 3 ASC의 문화 부모 플레이트가 약 70% 동률에 도달하면 ASC를 통과합니다. ASC 문화의 합류를 피하기 위해 주의하십시오. 1x 인산완충식염수로 플레이트를 부드럽게 헹구고 부착 세포를 트립시니화합니다. 세포를 트립시니화하기 위해, 인산완충 식염수를 흡인하고 각 플레이트에 0.25% EDTA를 가진 트립신 1 mL을 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양한다. 5 분 후, 현미경 검사법에 의한 순도 를 확인하십시오. 세포가 여전히 부착되어 있는 경우, 세포를 추가로 5분 동안 인큐베이터로 되감습니다. 소량의 용지(총 트립신 부피의 약 25%)를 플레이트에 추가하여 트립신을 비활성화하고, 매체/트립신을 사용하여 플레이트의 베이스를 부드럽게 세척합니다. 플레이트를 세척하려면 플레이트를 약간 비스듬히 잡고 플레이트 상단에서 아래쪽으로 미디어/트립신을 부드럽게 파이펫하여 플레이트에서 매주 부착된 셀을 느슨하게 합니다. 세포는 1:3 비율로 재도금되거나 플레이트당 120,000-500,000셀의 밀도로 시드될 수 있다. 세포 수에 기초하여 파종하는 경우, 플레이트에서 트립신/배지를 원추형 원심분리관으로 옮기고, 7분 동안 300 x g에서 원심분리하여 세포를 펠렛한다. 세포를 계산하기 위해, 혈세포 현탁액의 10 μL을 혈전계로 옮기고 그리드의 각 모서리에 있는 4 x 4 사분면에 존재하는 세포를 계산한다. 이러한 값을 함께 평균하고 값을 104로 곱하여 셀 번호를 계산합니다. 세포를 파종하기 전에 플레이트에 미디어를 추가합니다. 셀을 드롭 방식으로 추가한 다음 플레이트를 소용돌이로 돌리면 플레이트 전체에 균일한 분포가 보장됩니다.참고: 3개의 대고 후에, 부착된 세포는 비대칭 및 스핀들 모양으로 나타나야 합니다. ASC 표현형 및 거동은 유세포분석및 분화 분석기를 사용하여 확인할 수 있다. 유세포분석및분화분석술을이용한ASC표현형및행동체의확인 유세포분석 상기와 같이 세포를 수집하고 펠렛한다. 1x 인산완충식염수로 펠릿을 세척하고 제조업체가 권장하는 항체 볼륨으로 세포에 라벨을 붙입니다. 유세포분석, 일반적인 실험실 절차에 대한 자세한 프로토콜은 여기에서 찾을 수 있습니다12,14,15. ASC 표현형을 확인하기 위해 다음으로부터 표면 마커 패널을 선택한다: CD14, CD31, CD34, CD45 및 CD106에 대한 음수; CD29, CD36, CD44, CD73, CD90 및 CD10516,17,18,19에대해 긍정적입니다. CD36의 존재와 CD106의 부재는 골수 유래 MCS20에서ASC를 분별합니다. 분화 검사: MSC 분화 키트를 사용하여 다중 라인 차별화를 확인합니다. 키트는 여러 제조업체에서 지광, 골생성 및 콘드로겐성 분화 능력을 확인하기 위해 사용할 수 있습니다. 키트 제공 매체를 3주 동안 또는 형태학적 분별이 관찰될 때까지 제조업체의 프로토콜에 따라 3~4일마다 변경합니다. 여러 대통로에 대한 세포를 배양하는 단계; 필요한 구절의 수는 응용 프로그램에 따라 달라집니다. 각 계심에서, 전술한 세포 표면 마커를 사용하여 MSC 세포 형태및 표현형을 확인하고, 다중 라인 분화 능력이 손실되지 않았는지 확인한다. 확장 잠재력은 기증자 간에 다르지만 대부분의 샘플은 최대 6-9 개의 대구로 확장 될 수 있습니다. 세포를 냉동 보존하고 향후 사용을 위해 액체 질소에 보관하십시오. 4 ASC의 냉동 보존 동결 솔루션 A와 B의 10 mL를 준비합니다. 동결 용액 A의 경우, 높은 포도당DMEM에 20% FCS를 추가하십시오. 동결 용액 B의 경우, 20% FCS와 20% 디메틸 설파이드(DMSO)를 높은 포도당DMEM에 추가합니다. 펠렛 세포를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 5분 동안 동결액 A의 소량으로 세포를 재중단하고 3.3.1단계에서와 같이 혈세포계를 사용하여 세포를 카운트한다. 500,000-1,000,000 셀/mL의 최종 세포 농도에 도달하기 위해 세포가 다시 중단될 최종 부피를 계산합니다. 동결 용액 A를 사용하여 최종 부피의 50%에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 최종 세포 농도에 도달하기 위해 튜브를 교반하면서 동결 액 B의 동일한 부피를 천천히 추가하십시오. 즉시 1-2 mL 극저온에서 세포를 동결. -80°C에 놓인 냉동 용기 나 냉동 용기에 저온 을 동결시켜 온도를 1 °C / 분으로 줄입니다. 제어 된 동결 (동결 용기의 경우 하룻밤)에 따라 세포를 액체 질소로 옮겨 장기간 보관하십시오.