Une méthode sans enzyme s'est d'isolement et d'expansion des cellules souches mésenchymales dérivées de l'adipose humaine

L’utilisation d’échantillons de lipoaspirate et d’abdominoplastie a été approuvée par la Commission d’examen institutionnel (CISR) de l’Université Rutgers — Campus de Newark. 1. Préparation des médias de culture tissulaire Préparer sterilely 500 ml de médias de culture tissulaire avant d’isoler les ASC. Pour préparer les médias de culture, ajoutez 10 % de sérum foetal défini de veau (FCS) et de pénicilline-streptomycine (10 000 U/100 ml) au média essentiel minimal de Dulbecco (DMEM) avec un taux élevé de glucose et 2 mM de L-glutamine. Le support peut être stocké à 4 oC jusqu’à 3 semaines et doit toujours être utilisé chaud (entre la température ambiante et 37 oC). Si un média différent est préféré pour la culture des cellules souches, préparez-le plutôt. 2. Isolement des ASC du tissu adipeux Obtenir des lipoaspirates ou un échantillon d’abdominoplastie. Après l’approbation de la CISR, obtenir des échantillons comme le tissu de rejet à la suite de diverses interventions chirurgicales. Transporter les lipoaspirates au laboratoire dans n’importe quel navire le chirurgien a enlevé le tissu; transporter des échantillons d’abdominoplastie dans un sac ou un contenant de spécimens de salle d’opération. Conserver l’échantillon à température ambiante jusqu’à 6 h ou à 4 oC jusqu’à 24 h si ce n’est pas le traitement immédiat. Les échantillons de tissus traités au-delà des périodes susmentionnées auront probablement une diminution du rendement cellulaire. Gardez les échantillons d’abdominoplastie humides par l’ajout de 1x phosphate stérile tamponné salin. À partir de ce moment, effectuez toutes les étapes d’une hotte à débit laminaire dans des conditions aseptiques. Portez des gants pour une protection personnelle. Gardez 10 % d’eau de Javel, 70 % d’éthanol et des serviettes en papier à proximité pour nettoyer rapidement tout déversement biologique. Éliminé de tout excès de tissu comme déchets biomédicaux. Émincer les échantillons en morceaux de 1 mm. Si le bloc d’abdominoplastie est trop grand pour fonctionner avec, couper une taille gérable de tissu hors du bloc avant de hacher. Transférer le tissu abdominoplastie sur le couvercle d’une plaque stérile de 100 mm. Utilisez une aiguille stérile pour maintenir un morceau de tissu en place et utilisez un scalpel stérile pour hacher les morceaux en coupant ou en détritant doucement le tissu en vrac. Cette étape n’est généralement pas nécessaire pour les lipoaspirates. Cependant, si de gros morceaux de tissu sont observés dans le lipoaspirate, enlever ces morceaux avec des forceps stériles et le processus comme ci-dessus. Transférer le tissu dans un tube frais et inverser ou secouer l’échantillon 5 à 6 fois pour assurer le mélange de toutes les couches. Facultatif : si le lipoaspirate est complètement installé, retirez et jetez la couche d’huile avant le mélange. Transférer 2,5 à 5 ml de tissu dans une plaque de culture de tissu traitée au plasma de 100 mm(tableau des matériaux). Mesurer le volume de l’échantillon en versant dans un tube de centrifugeuse fraîche. Si nécessaire, utilisez une spatule stérile pour aider au transfert du tissu. Ajouter un volume équivalent de supports de culture tissulaire à la plaque. Faites tourbillonner doucement la plaque pour mélanger le contenu. Incuber les pâtés à 37 oC dans 5 % de CO2 jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de cellules soient observés sur la base de la plaque. Au fil du temps, les cellules migreront de l’intérieur du tissu sur la surface de la plaque, à ce moment-là, ils adhéreront au plastique. À leur sortie du tissu, les cellules apparaissent sous forme de petits groupes autour des morceaux de tissu. Tous les 24 h, retirer autant de liquide que possible et remplacer par une quantité similaire de médias. Laissez les morceaux de tissu en place, si possible. Une fois qu’un nombre suffisant de cellules sont notés sur la plaque (les grappes de 15 à 25 cellules restantes sur la plaque) ou après 7 jours, selon le plus tôt, enlever tous les morceaux de tissu restants. Culture les ASC dans les milieux de culture tissulaire jusqu’à ce qu’ils atteignent 70% de confluence ou jusqu’à ce que les grappes deviennent denses (-5 grappes denses de cellules sur la plaque, chacun avec un diamètre d’environ 500 ‘m), à quel point les cellules doivent être passages. 3 Culture des ASC Passer les NAC lorsque la plaque mère atteint environ 70% de confluence. Veillez à éviter la surconsommation des cultures ASC. Rincer délicatement la plaque avec 1x phosphate tamponné saline et trypsiniser les cellules adhérentes. Pour trypsiniser les cellules, aspirer le phosphate tamponné saline et ajouter 1 ml de trypsine avec 0,25% EDTA à chaque plaque et incuber à 37 oC pendant 5 min. Après 5 min, confirmer la désadhérence par microscopie. Si les cellules sont encore adhérentes, remettez les cellules à l’incubateur pendant 5 min supplémentaires. Ajouter une petite quantité de support (environ 25% du volume total de trypsine) à la plaque pour désactiver la trypsine, et laver doucement la base de la plaque en utilisant le média / trypsine. Pour laver la plaque, maintenez la plaque à un léger angle et doucement pipette le média / trypsine du haut de la plaque vers le bas, desserrer toutes les cellules attachées hebdomadaires de la plaque. Les cellules peuvent être re-plaquées à un rapport 1:3 ou ensemencées à une densité de 120 000 à 500 000 cellules par plaque. Si l’ensemencement est basé sur le nombre de cellules, transférez la trypsine/média de la plaque dans un tube conique de centrifugeuse, et pelletez les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 7 min. Resuspendre les cellules dans le support de culture tissulaire (environ 1 ml par plaque initiale) et compter les cellules avant l’ensemencement. Pour compter les cellules, transférez 10 l l de la suspension cellulaire dans l’hémocytomètre et comptez les cellules présentes dans le quadrant 4 x 4 à chaque coin de la grille. Moyenne de ces valeurs ensemble et de multiplier la valeur par 104 pour calculer le nombre de cellules. Ajouter le support à la plaque avant d’ensemencer les cellules. Ajouter les cellules d’une manière dropwise, puis tourbillonner la plaque pour assurer une distribution uniforme à travers la plaque.REMARQUE : Après 3 passages, les cellules adhérentes doivent apparaître asymétriques et en forme de fuseau. Le phénotype et le comportement de l’ASC peuvent être confirmés à l’aide de la cytométrie du débit et des tests de différenciation. Confirmation du phénotype et du comportement assominaux à l’aide de la cytométrie du débit et des tests de différenciation Cytométrie de flux Recueillir et granuler les cellules comme décrit ci-dessus. Laver les granulés avec 1x phosphate tamponné saline et étiqueter les cellules avec le fabricant des volumes recommandés d’anticorps. Un protocole détaillé pour la cytométrie de flux, une procédure de laboratoire commune, peut être trouvé ici12,14,15. Sélectionnez des panneaux de marqueurs de surface de ce qui suit pour confirmer le phénotype ASC : négatif pour CD14, CD31, CD34, CD45 et CD106; et positif pour CD29, CD36, CD44, CD73, CD90, et CD10516,17,18,19. La présence de CD36 et l’absence de CD106 discernent les ASC des MSC dérivés de la moelleosseuse 20. Résultats de différenciation : Confirmer la différenciation multilinéaire à l’aide d’un kit de différenciation MSC. Des kits sont disponibles auprès de plusieurs fabricants pour confirmer la capacité de différenciation adipogénique, ostéogénique et chondrogénique. Modifier les supports fournis par le kit tous les 3 à 4 jours selon les protocoles du fabricant pendant 3 semaines ou jusqu’à ce que la différenciation morphologique soit observée. Culture des cellules pour de multiples passages; le nombre de passages nécessaires dépendra de l’application. À chaque passage, confirmer la morphologie et le phénotype des cellules MSC à l’aide des marqueurs de surface des cellules susmentionnés, et s’assurer que la capacité de différenciation multilinéaire n’a pas été perdue. Bien que le potentiel d’expansion diffère d’un donneur à l’autre, la plupart des échantillons peuvent être étendus jusqu’à 6 à 9 passages. Cryopreserve les cellules et stocker dans l’azote liquide pour une utilisation future. 4 Cryoconservation des AsC Préparer 10 ml de solutions de congélation A et B. Pour la solution de congélation A, ajouter 20% de FCS à DMEM avec un taux de glucose élevé. Pour la solution de congélation B, ajouter 20 % de FCS et 20 % de sulfure de diméthyle (DMSO) à DMEM avec un taux de glucose élevé. Pelleter les cellules en centrifuge anticifiant 300 x g pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans un petit volume de solution de congélation A et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre comme à l’étape 3.3.1. Calculez le volume final dans lequel les cellules seront remises en suspension pour atteindre une concentration cellulaire finale de 500 000 à 1 000 000 de cellules/mL. Utilisez la solution de congélation A pour resuspendre la pastille dans 50 % de ce volume final. Ajouter lentement un volume égal de solution de congélation B goutte à goutte tout en agitant le tube pour atteindre la concentration cellulaire finale. Congelez immédiatement les cellules en cryovials d’une vingtaine de ml. Congeler les cryovials dans un congélateur à débit contrôlé ou dans un contenant de congélation placé à -80 oC, ce qui diminue la température de 1 oC/min. Après le gel contrôlé (pendant la nuit pour un contenant de congélation), transférer les cellules à l’azote liquide pour le stockage à long terme.