一种分离和扩增人类脂肪衍生的美源性干细胞的无酶方法

罗格斯大学纽瓦克校区机构审查委员会（IRB）已批准使用脂吸性和腹肌成形性样品。 1. 组织培养的制备 在隔离 ASC 之前，无菌地准备 500 mL 的组织培养培养。要制备培养基，在 Dulbeco 的最小必需介质 （DMEM） 中加入 10% 定义的胎儿小牛血清 （FCS） 和青霉素-链霉素 （10，000 U/100 mL）， 以及高葡萄糖和 2 mM L-谷氨酰胺。介质可在 4°C 下存储长达 3 周，应始终使用加热（室温至 37°C）。 如果干细胞培养首选不同的介质，请改为准备该介质。 2. 从脂肪组织分离ASC 获取脂吸量或腹肌成形样品。IRB批准后，按照各种外科手术获取丢弃组织等样本。将脂吸气者运送到实验室，无论外科医生在哪个容器内取出组织;在手术室标本袋或容器中运输腹肌切片。 如果不立即处理，将样品在室温下储存长达 6 小时或 4°C，长达 24 小时。超过上述时间处理的组织样本可能会降低细胞产量。通过添加1x无菌磷酸盐缓冲盐水，保持腹膜成形样品湿润。 从此时起，在无菌条件下，在层流罩中执行所有步骤。戴手套以进行人身保护。保持10%的漂白剂，70%的乙醇，和纸巾附近，以迅速清理任何生物泄漏。将任何多余的组织作为生物医学废物处理。 将样品切成 < 1 mm 件。如果腹肌块太大，无法使用，则在切碎之前，将可管理的组织大小从块中切下。将腹肌整形组织转移到无菌 100 mm 板的盖子上。使用无菌针头将一块组织放在原位，并使用无菌手术刀将大块切碎，通过切割或轻轻切碎散装组织来切碎。 脂分子通常不需要此步骤。然而，如果在脂蛋白中观察到大组织块，用无菌钳子去除这些块，并按照上述处理。 将组织转移到新鲜的管子中，将样品反转或摇动 5~6 次，以确保所有层的混合。可选：如果脂吸气已完全稳定，在混合前取出并丢弃油层。 将2.5~5 mL的组织转移到100毫米真空-气体血浆处理的组织培养板（材料表）。通过倒入新的离心管测量样品的体积。如有必要，使用无菌铲子帮助转移组织。 向板中加入同等体积的组织培养培养物。轻轻旋转板以混合内容物。 在5%CO2中孵育37°C的拍片，直到在板的底座上看到足够数量的细胞。随着时间的推移，细胞会从组织内迁移到板表面，此时它们会粘附在塑料上。当细胞离开组织时，细胞会以组织碎片周围的小簇出现。 每 24 小时，清除尽可能多的液体，并更换具有类似数量的介质。如果可能，将组织块留在原位。 一旦在板上记录到足够数量的细胞（>10组>15-25个细胞在板上）或7天后（以较早者为准），取出所有剩余的组织。 在组织培养基培养基培养中培养ASC，直到它们达到70%的汇合，或直到簇变得致密（在板上有5个密集的细胞簇，每个细胞的直径约为>500 μm），此时细胞将被传递。 3 ASC 文化 当母板达到约 70% 的汇合时，通过 ASC。注意避免 ASC 区域性的汇合。 用1倍磷酸盐缓冲盐水轻轻冲洗盘子，并试穿粘附细胞。为了试穿细胞，吸出磷酸盐缓冲盐水，并在每个板中加入1 mL的0.25TA的胰蛋白酶，并在37°C孵育5分钟。5分钟后，通过显微镜确认去粘坚持。如果细胞仍然粘附，将细胞返回到孵化器再延长5分钟。 向板中加入少量介质（约占试金总体积的 25%），以停用胰蛋白酶，并使用介质/胰蛋白酶轻轻清洗板底。要洗净板，请以轻微角度握住板，然后轻轻地将介质/胰蛋白酶从板顶部向下移移，从板上松开任何每周连接的细胞。细胞可以以1：3的比例重新镀层，或以每板120，000-500，000个细胞的密度播种。 如果根据细胞计数进行播种，将胰蛋白酶/培养基从板转移到圆锥形离心管中，并在300 x g下离心7分钟，将细胞悬浮在组织培养基中（每个初始板约1 mL），并在播种前对细胞进行计数。要对细胞进行计数，将细胞悬浮液的 10 μL 转移到血细胞计中，并计算网格每个角落的 4 x 4 象限中的细胞。将这些值平均一起，并将该值乘以 104以计算单元格数。 在播种细胞之前，向板中添加介质。以滴落的方式加入细胞，然后旋转板，以确保均匀分布在板上。注：在3个通道后，附着细胞应出现不对称和主轴形状。ASC表型和行为可以通过流式细胞测定和分化测定来确认。 使用流式细胞测定和微分测定确认ASC表型和行为 流动细胞仪 如上所述，收集和颗粒细胞。用1倍磷酸盐缓冲盐水清洗颗粒，用制造商推荐的抗体量标记细胞。流动细胞学的详细方案，一种常见的实验室程序，可以在这里找到12，14，15。 从下面选择表面标记面板以确认 ASC 表型：CD14、CD31、CD34、CD45 和 CD106 的负极;CD29、CD36、CD44、CD73、CD90 和 CD10516、17、18、19。CD36的存在和CD106的缺失从骨髓衍生的MSCs20中分辨ASCs。 差别化检测：使用MSC分化试剂盒确认多系分化。多个制造商提供试剂盒，用于确认异质性、骨性和软骨性分化能力。根据制造商的协议，每 3⁄4 天更换一次套件提供的介质，为期 3 周或直到观察到形态分化。 培养多个段落的细胞;所需的段落数量取决于应用程序。在每个段落中，使用上述细胞表面标记确认MSC细胞形态和表型，并确保多系分化能力没有丧失。虽然捐助者的扩张潜力不同，但大多数样本可以扩大至多6-9个段落。 冷冻保存细胞并储存在液氮中，以供将来使用。 4 ASC 的冷冻保存 准备 10 mL 的冷冻溶液 A 和 B。 对于冷冻溶液A，在高血糖的DMEM中加入20%的FCS。 对于冷冻溶液B，在高血糖的DMEM中加入20%的FCS和20%的二甲基硫化物（DMSO）。 在300 x g下离心5分钟，将细胞悬浮在少量冷冻溶液A中，并使用血细胞计对细胞进行计数，如步骤3.3.1。 计算细胞被重新悬浮的最终体积，最终细胞浓度达到500，000~1，000，000细胞/mL。使用冷冻溶液 A 将颗粒重新悬浮到最终体积的 50%。缓慢地加入相等体积的冷冻溶液B滴落，同时搅拌管达到最终细胞浓度。 立即将细胞冷冻在1⁄2 mL冷冻室中。将冷冻液冷冻在受控速率的冰柜或置于-80°C的冷冻容器中，使温度降低1°C/分钟。在受控冷冻（冷冻容器过夜）后，将细胞转移到液氮中，以便长期储存。