Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용
Summary
Reproducibly 개별 oocytes, 단일 분자 RNA 형광 제자리에서 mRNAs의 숫자를 카운트를 교 잡 (RNA-물고기) 비 부착 한 세포에 대 한 최적화 되었다. Oocytes 수집 했다, 대 본 특정 프로브 때 교배 하 고 이미지 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 계량.
Abstract
정기적으로 oocytes에서 배아 mRNA를 측정 하는 데 사용 하는 현재 방법 디지털 역 전사 연쇄 반응 (dPCR), 양적, 실시간 RT-PCR (RT-정량) 및 RNA 시퀀싱 포함 됩니다. 이러한 기술은 단일 oocyte 또는 배아를 사용 하 여 수행 됩니다, 낮은 복사 mRNAs 안정적으로 검색 되지 않습니다. 이 문제를 해결 하려면 oocytes 또는 배아 수 수 풀링된 함께 분석; 그러나,이 종종 샘플 중 높은 가변성에 이어집니다. 이 프로토콜에서 우리 형광 제자리 교 잡 (물고기) 분기 DNA 화학을 사용 하 여의 사용을 설명 합니다. 이 기술은 개별 셀에서 mRNAs의 공간적 패턴을 식별합니다. 기술은 자리 찾아서 추적 컴퓨터 소프트웨어와 결합 되어 때 셀에서 mRNAs의 풍부도 측정할 수 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여, 실험적인 그룹에서 감소 변화 이며 적은 oocytes 및 배아 실험 그룹 간의 중요 한 차이 검출 해야. 상업적으로 사용 가능한 분기 DNA SM-물고기 키트 sectioned 조직 또는 슬라이드에 부착 세포 mRNAs를 검색에 최적화 되었습니다. 그러나, oocytes 효과적으로 슬라이드에 고착 하지 않는다 고 일부 시 약 키트에 oocyte 세포의 결과로 너무 가혹 했다. 이 세포의 용이 해를 방지 하기 위해, 물고기 키트 여러 수정 되었다. 특히, oocyte permeabilization 및 워시 버퍼를 oocytes와 태아의 면역 형광을 위한 독점 버퍼를 교체 했습니다. Permeabilization, 세척, 그리고 프로브와 앰프 외피 6 잘 플레이트에서 수행한 고 oocytes 슬라이드 설치 미디어를 사용 하 여 프로토콜의 끝에 배치 했다. 이러한 수정 상용 키트, 특히, oocyte 세포의 한계를 극복할 수 있었다. 정확 하 게 그리고 reproducibly 개별 oocytes에서 mRNAs의 수를 계산, 컴퓨터 소프트웨어 사용 되었다. 함께,이 프로토콜 PCR 및 시퀀싱을 비교할 단일 셀에 특정 성적 표현 하는 대안을 나타냅니다.
Introduction
역전사 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) mRNA 정량에 대 한 황금 표준 되었습니다. 2 분석 실험, 디지털 PCR (dPCR)1 과 양적, 리얼 타임 PCR (정량)2 현재 사용 됩니다. 두 개의 PCR 기법, dPCR 그것은 단일 세포에서 mRNA 풍부를 측정 하는 데 사용할 수 제안 하는 정량 보다 더 큰 감도 있다. 그러나, 우리 손에 각 실험 샘플 당 5 ~ 10 oocytes의 수영장에서 낮은 풍부 mRNAs의 dPCR 분석은 생산 데이터 낮은 재현성 및 높은 변화3. 이 RNA 추출 및 반전 녹음 방송 효율성과 관련 된 실험적인 오류로 인해 높습니다. RNA 시퀀싱도 하나의 마우스와 인간의 oocytes4,5를 사용 하 여 수행 되었습니다. 이 기술은 가능성이 실험적인 그룹 내의 다양성을 증가 하는 라이브러리 생성에 필요한 cDNA 증폭 단계를 해야 합니다. 또한, 낮은 풍부 성적표 감지 하지 않을 수 있습니다. 시퀀싱 가격은 지난 몇 년 동안 추락, 비록 그것은 여전히 비용 생물 정보학 분석의 높은 비용 때문에 금지 수 있습니다. 마지막으로, mRNA 지역화 단백질 기능6에 기여 하는 공간 변경 동적 과정 이다. 따라서, 우리는 정확 하 고 재현 가능한 정량적 측정 및 단일 oocytes에서 개별 mRNAs의 지역화 생성 하는 기술 채택에 밖으로 설정.
분기 DNA 형광 제자리 교 잡에서에 결합 된 개별 셀 7,,89단일 mRNAs의 증폭 RNA/cDNA 활성화 탐지 보다는 형광 신호를 증폭 한다. 분석 결과 교 잡, 증폭 (분기 DNA를 사용 하 여), 및 형광 형광 신호7증폭 하기 위하여 단계를 라벨의 시리즈를 통해 수행 됩니다. 기술은 특정 mRNA3,,810를 보완 하는 18-25 베이스 oligonucleotide 조사 쌍의 바인딩으로 시작 합니다. 15 ~ 20 프로브 쌍 대상 성적에 대 한 각 사본 보장 특이성에 대 한 설계 되었습니다. MRNA 전용 하이브리드 프리 앰프 및 증폭기 프로브 분기 구성 구성 하 옵니다. 약, 400 라벨 fluorophores 개별 mRNAs (그림 1)11의 탐지를 허용 하는 형광에 8000-fold 증가 결과로 각 증폭기에 바인딩합니다.
그림 1: SM 물고기 프로토콜의 도식. 대 본 특정 조사의 순차적 교 잡 DNA 증폭기 및 mRNA 표시 대상에 fluorophore 분기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
개별 뉴런12 에 인간 유 두 종 바이러스 DNA에 자 궁 경부 암 제자리 교 잡 (SM-물고기) 지역화 된 β-말라 mRNAs에 있는 단일 분자 형광을 사용 하 여 이전 연구 라인7세포. 자리 찾기는 컴퓨터 소프트웨어 및 추적 프로그램 개별 punctate 형광 신호를 식별 하 고 각 셀3,13mRNAs의 수 척도를 성공적으로 사용 되었습니다.
신경12mRNA 검색의 결과 바탕으로, 우리 SM 물고기 quantitate murine oocytes에서 배아 낮은 풍부 mRNAs를 포함 한 성적 수준에 유용한 도구를 증명할 것을 가정 했다. 그러나, 기술은 부착 고정된 셀과 함께 사용 하기 위해 최적화와 포름알데히드 파라핀 고정 임베디드 (FFPE) 조직 단면도. Oocytes 그들은 폴 리-L-리 신을 코팅 하는 경우에 슬라이드를 준수 수 없습니다. 또한, 그들은 체세포와 직물 단면도 세포 세포의 용 해 상용 키트3독점 버퍼의 일부를 받게 될 때의 결과 보다 더 약 합니다. 이러한 과제를 극복 하기 위해 oocytes는 고정 되었고 수동으로 버퍼의 방울 사이 전송. 또한, 키트에 permeabilization 및 워시 버퍼 세포 세포의 용 해를 감소 시키기 위하여 대체 되었다. 미리 디자인 된 프로브 물고기 키트와 함께 구입 또는 특정 성적 증명서를 요청할 수 있습니다. 각 독자적인 프로브 세트는 3 개의 형광 채널 (C1, C2, 및 C3) 다중화 허용 중 하나에. 현재 실험에 murine oocytes 듀얼 스테인드과 C2 Nanog 프로브와 C3 Pou5f1 프로브를 사용 하 여 계량 했다. 이 프로브 oocytes에서 배아 Nanog 와 Pou5f1 의 보고 된 식에 따라 선정 됐다. 교 잡 단계의 결론에 oocytes 조직학 슬라이드에 응용 프로그램에 대 한 방지 페이드 설치 미디어의 방울에 배치 했다. 공초점 이미지 개별 mRNAs를 대표 하는 punctate 형광 신호 수 계량에 사용 되었다. 영상 또한 셀에 특정 mRNA의 공간적 분포를 보였다는 mRNAs를 측정 이외에 다른 RNA 정량화 방법 달성할 수 없습니다. 이 기술은 실험 그룹3사이의 중요 한 차이점을 식별 하기 위해 각 실험 그룹에 oocytes의 작은 숫자의 사용을 허용 하는 실험적인 그룹 내에서 낮은 다양성을 입증 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
일련의 작은 단계 프로토콜 동안 mRNAs의 성공적인 형광 및 정확한 보장 합니다. 첫째, 프로토콜 수집과 oocytes의 고정 후에 즉시 수행 되어야 합니다. Note PVP oocytes 서로에 집착 하지 않도록 4 %paraformaldehyde 고정 버퍼에 추가 됩니다. 우리 컬렉션은 oocytes의 고정 후 즉시 실험을 수행 하는 데 필요한 발견. 어떤 지연 결과 훨씬 낮은 형광 신호를 녹취 록의 undercounting 귀 착될 것입니다. 이것은 때문에 RNA …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
설치 및 사용 자리 찾아서 추적 프로그램 13 의 confocal 현미경 이미징에 대 한 대학 네브라스카 링컨 현미경 코어의 기술 지원 그의 관대 한 도움에 감사 박사 다니엘 R. 라 슨 하 고. 이 연구는 네브라스카 농업 연구 부문, 링컨, 네브라스카 대학에의 기여도 나타냅니다과 UNL 해치 자금 (코-26-206/가입 번호-232435 및 코-26-231/승인 번호-1013511)에 의해 지원 되었다.
Materials
| (±)-α-Lipoic acid | Sigma-Aldrich | T1395 | Alpha Lipoic Acid |
| Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid | MP Biomedicals, LLC | 199899 | FAF BSA |
| BD 10mL TB Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 10 mL syringe |
| BD PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Company | 305109 | 27 1/2 gauge needle |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | CaCl2-2H2O |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | Citrate |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | Glucose |
| Disodium phosphate | Na2HPO4 | ||
| Easy Grip Petri Dish | Falcon Corning | 351008 | 35 mm dish |
| Edetate Disodium | Avantor | 8994-01 | EDTA |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta biologicals | S10250 | FBS |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15710-064 | Gentamicin |
| GlutaMAX-I (100X) | gibco | 35050-061 | Glutamax |
| Gold Seal Micro Slides | Gold Seal | 3039 | 25 x 75mm slides |
| Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum | Sigma | G4877 | eCG |
| hCG recombinant | NHPP | AFP8456A | hCG |
| Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes | Sigma-Aldrich | H3884 | Hyaluronidase |
| Jewelers Style Forceps | Integra | 17-305X | Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw |
| L-(+)-Lactic Acid, free acid | MP Biomedicals, LLC | 190228 | L-Lactate |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M2773 | MgSO4-7H2O |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-Cl | NEAA |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-C | 25 x 25x 0.15 mm cover slips |
| Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe | Advanced Cell Diagnostics | 501891-C2 | Nanog Probe |
| Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe | Advanced Cell Diagnostics | 501611-C3 | Pou5f1 Probe |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Paraformaldehyde |
| PES 0.22 um Membrane -sterile | Millex-GP | SLGP033RS | 0.22 um filters |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P0930 | PVP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60128 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60218 | KH2PO4 |
| Prolong Gold antifade reagent | invitrogen | P36934 | Antifade reagent without DAPI |
| RNAscope DAPI | Advanced Cell Diagnostics | 320858 | DAPI |
| RNAscope FL AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 320852 | Amplifier 1 |
| RNAscope FL AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 320853 | Amplifier 2 |
| RNAscope FL AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 320854 | Amplifier 3 |
| RNAscope FL AMP 4 ALT A | Advanced Cell Diagnostics | 320855 | Amplifier 4 ALT A |
| RNAscope FL AMP 4 ALT B | Advanced Cell Diagnostics | 320856 | Amplifier 4 ALT B |
| RNAscope FL AMP 4 ALT C | Advanced Cell Diagnostics | 320857 | Amplifier 4 ALT C |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320851 | FISH Reagent Kit |
| RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics | 320871 | Negative Control |
| RNAscope Probe 3-plex Positive Control | Advanced Cell Diagnostics | 320881 | Positive Control |
| RNAscope Probe Diluent | Advanced Cell Diagnostics | 300041 | Probe Diluent |
| RNAscope Protease III | Advanced Cell Diagnositics | 322337 | Protease III |
| RNAscope Protease III & IV Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 322340 | FISH Protease Kit |
| RNAscope Protease IV | Advanced Cell Diagnostics | 322336 | Protease IV |
| S/S Needle with Luer Hub 30G | Component Supply Co. | NE-301PL-50 | blunt 30 gauge needle |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S6191 | NaCl |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 306576 | NaOH |
| Sodium pyruvate, >= 99% | Sigma-Aldrich | P5280 | Pyruvate |
| Solution 6 Well Dish | Agtechinc | D18 | 6 well dish |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | Taurine |
| Tissue Culture Dish | Falcon Corning | 353002 | 60 mm dish |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Triton X-100 |
Riferimenti
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