विलायक-स्पष्ट मस्तिष्क ऊतक में रेबीज वायरस संक्रमण के उच्च संकल्प 3 डी इमेजिंग
Summary
उपन्यास, विलायक-स्पष्ट अंगों के अंतिम 3 डी इमेजिंग की तरह इम्यूनोस्टेनिंग-संगत ऊतक समाशोधन तकनीक रेबीज वायरस मस्तिष्क संक्रमण और इसके जटिल सेलुलर वातावरण के 3 डी दृश्य की अनुमति देते हैं। मोटी, एंटीबॉडी लेबल मस्तिष्क ऊतक स्लाइस इमेजिंग गहराई बढ़ाने के लिए और confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी विश्लेषण सक्षम करने के लिए ऑप्टिकली पारदर्शी बना रहे हैं।
Abstract
प्रतिरक्षा लेबलिंग द्वारा ऊतकों और अंगों में संक्रमण प्रक्रियाओं का दृश्य आधुनिक संक्रमण जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण तरीका है। अंग ऊतकों के अंदर वितरण, ट्रोपिज्म, और रोगजनकों की बहुतायत का निरीक्षण और अध्ययन करने की क्षमता रोग के विकास और प्रगति पर निर्णायक डेटा प्रदान करती है। पारंपरिक माइक्रोस्कोपी तरीकों का उपयोग करना, इम्यूनोलेबलिंग ज्यादातर पैराफिन-एम्बेडेड या जमे हुए नमूनों से प्राप्त पतली वर्गों तक सीमित है। हालांकि, इन पतली वर्गों के सीमित 2 डी छवि विमान एक संक्रमित अंग की जटिल संरचना और संक्रमण के सेलुलर संदर्भ पर महत्वपूर्ण जानकारी के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. आधुनिक बहुरंगा, इम्यूनोस्टेनिंग-संगत ऊतक समाशोधन तकनीक अब वायरस संक्रमित अंग ऊतक के उच्च मात्रा 3 डी छवि ढेर का अध्ययन करने के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से और सस्ती तरीका प्रदान करते हैं। कार्बनिक सॉल्वैंट्स के लिए ऊतक को उजागर करके, यह ऑप्टिकली पारदर्शी हो जाता है। यह नमूने के अपवर्तक सूचकांकों से मेल खाता है और अंततः प्रकाश प्रकीर्णन में महत्वपूर्ण कमी की ओर जाता है। इस प्रकार, लंबे समय से मुक्त काम दूरी के उद्देश्यों के साथ संयोजन में, बड़े ऊतक वर्गों अप करने के लिए 1 मिमी आकार में उच्च संकल्प पर पारंपरिक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) द्वारा छवि बनाई जा सकती है। यहाँ, हम संक्रमित दिमाग में रेबीज वायरस वितरण की कल्पना करने के लिए ऊतक समाशोधन के बाद गहरी ऊतक इमेजिंग लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए वायरस रोगजनन, प्रसार, tropism, और neuroinvasion जैसे विषयों का अध्ययन करने के लिए।
Introduction
पारंपरिक ऊतक विज्ञान तकनीक ज्यादातर अंग ऊतकों की पतली वर्गों पर भरोसा करते हैं, जो स्वाभाविक रूप से एक जटिल 3 डी वातावरण में केवल 2 डी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. यद्यपि सिद्धांत रूप में व्यवहार्य है, धारावाहिक पतली वर्गों से 3 डी पुनर्निर्माण दोनों टुकड़ा करने और बाद में अधिग्रहीत छवियों1के silico संरेखण में तकनीकी पाइपलाइनों की मांग की आवश्यकता है. इसके अलावा, माइक्रोटोम टुकड़ा करने के बाद z-volumes का निर्बाध पुनर्निर्माण महत्वपूर्ण है क्योंकि यांत्रिक और संगणकीय कलाकृतियां, गैर-ओवरलेपिंग छवि विमानों, धुंधला विविधताओं, और भौतिक के कारण suboptimal छवि पंजीकरण के कारण बनी रह सकती हैं द्वारा ऊतक का विनाश, उदाहरण के लिए, microtome ब्लेड. इसके विपरीत, बरकरार मोटी ऊतक के नमूनों की शुद्ध ऑप्टिकल टुकड़ा करने की अनुमति देता है ओवरलैपिंग छवि विमानों के अधिग्रहण (ओवरसाम्पलिंग) और, जिससे, 3 डी पुनर्निर्माण की सुविधा. यह, बारी में, जटिल सेल आबादी में संक्रमण प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए बेहद फायदेमंद है (उदाहरण के लिए, आसपास के glial और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संदर्भ में न्यूरॉन नेटवर्क). हालांकि, मोटी ऊतक वर्गों के अंतर्निहित बाधाओं प्रकाश प्रकीर्णन और ऊतक में सीमित एंटीबॉडी प्रवेश शामिल हैं. हाल के वर्षों में, विभिन्न प्रकार की तकनीकों का विकास किया गया है और इन मुद्दों को दूर करने के लिए अनुकूलित किया गया है2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. मूलतः , लक्ष्य ऊतकों या तो जलीय2,3,4,5,6,7 के साथ उपचार द्वारा ऑप्टिकली पारदर्शी कर रहे हैं ,8,9 या कार्बनिक विलायक आधारित10,11,12,13 समाधान. 3DISCO की शुरूआत (3 डी विलायक-स्पष्ट अंगों की इमेजिंग)11,12 और उसके उत्तराधिकारी uDISCO (विलायक-स्पष्ट अंगों के अंतिम 3 डी इमेजिंग)13 के साथ एक अपेक्षाकृत तेजी से, सरल, और सस्ती उपकरण प्रदान की उत्कृष्ट समाशोधन क्षमताओं. समाशोधन प्रोटोकॉल के मुख्य घटक कार्बनिक सॉल्वैंट्स tert-butanol (TBA), बेंजिल शराब (बीए), बेंजिल बेंजोएट (बीबी), और डिफेनिल ईथर (डीपीई) हैं। IDISCO के विकास और इसके अलावा (प्रतिरक्षा-सक्षम 3 डी विलायक-स्पष्ट अंगों की इमेजिंग)14, एक संगत इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल, मौजूदा तरीकों पर एक और लाभ का गठन किया और एंटीजन के गहरे ऊतक लेबलिंग सक्षम ब्याज की, साथ ही प्रतिरक्षा नमूनों की लंबी अवधि के भंडारण। इस प्रकार, iDISCO14 और uDISCO13 के संयोजन के लिए अनुमति देता है उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए बड़े ऊतक वर्गों में एंटीबॉडी लेबल प्रोटीन (अप करने के लिए 1 मिमी) पारंपरिक CLSM का उपयोग कर.
सभी तीन आयामों में एक अंग की जटिल संरचना का संरक्षण मस्तिष्क के ऊतकों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। न्यूरॉन्स उनके neurite अनुमानों के आधार पर अत्यधिक विविध 3 डी morphologies के साथ एक बहुत विषम सेलुलर उपजनसंख्या शामिल (मसान द्वारा की समीक्षाकी 15). इसके अलावा, मस्तिष्क डिब्बों और subcompartments की एक संख्या के होते हैं, प्रत्येक विभिन्न सेलुलर subpopulations और उसके अनुपात से बना, glial कोशिकाओं और न्यूरॉन्स सहित (Von Bartheld एट अल द्वारा की समीक्षा की.16). एक neurotropic वायरस के रूप में, रेबीज वायरस (RABV, Fooks एट अल द्वारा समीक्षा की17)मुख्य रूप से न्यूरॉन्स को संक्रमित, उनके परिवहन मशीनरी का उपयोग करने के लिए संक्रमण के प्राथमिक स्थल से कुल्हाड़ी में प्रतिगामी दिशा में यात्रा करने के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस). यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल (चित्र 1ए) संक्रमित मस्तिष्क के ऊतकों से प्राप्त बड़े, सुसंगत छवि ढेर में RABV और RABV संक्रमित कोशिकाओं के इम्यूनोस्टेनिंग-सहायता प्राप्त पता लगाने और दृश्य के लिए अनुमति देता है। यह संक्रमण वातावरण के एक निष्पक्ष, 3 डी उच्च संकल्प मूल्यांकन सक्षम बनाता है। यह प्रजातियों की एक किस्म से मस्तिष्क के ऊतकों के लिए लागू है, निर्धारण के तुरंत बाद या paraformaldehyde (पीएफए) में नमूनों की लंबी अवधि के भंडारण के बाद किया जा सकता है, और भंडारण और महीनों के लिए दाग और मंजूरी दे दी नमूनों के reimaging की अनुमति देता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हाल के वर्षों में ऊतक समाशोधन तकनीकों का पुनरुत्थान और आगे विकास2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , <sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने थॉमस सी Mettenleiter और Verena te Kamp को समीक्षकों द्वारा पांडुलिपि पढ़ने के लिए धन्यवाद दिया। इस काम Mecklenburg पश्चिमी Pomerania और यूरोपीय सामाजिक कोष (ESF) अनुदान KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) और Lyssaviruses पर एक intramural सहयोगी अनुसंधान अनुदान के संघीय उत्कृष्टता पहल द्वारा समर्थित किया गया था पर Lyssaviruses पर फ्रेडरिक-लॉफलर-इंस्टीट्यूट (री-0372)।
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
Riferimenti
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