Interroger les centres germinatifs autoréactifs individuels par Photoactivation dans un modèle mixte chimérique de l’auto-immunité

Tous les animaux utilisés étaient conformes aux orientations de la communauté européenne et a été approuvé par l’inspection de recherche Animal danois (2017-15-0201-01348). 1. l’élevage de souris Généralités et préparation des tampons et des outils Lignées de souris de maison dans des conditions (SPF) gratuites agent pathogène spécifique, avec un suivi périodique de l’état de santé selon les directives standard. Facultatif : vérifier l’absence de centres germinatifs spontanées chez les souris naïves à une infection accidentelle non surveillés. Cela peut se faire soit par microscopie d’immunofluorescence (présence de structures de centre germinatif) ou cytométrie en flux (fréquence des cellules de centre germinatif B) comme décrit précédemment12.Remarque : Soit les femmes ou les hommes peuvent être utilisés. En règle générale, il est idéal pour sexe match donneurs et les receveurs, comme une incompatibilité du sexe peut théoriquement conduire à alloreactivity vers l’antigène Y mâle par les bénéficiaires et les donateurs femelle15. Utilisation CD45.1 destinataires (B6. SJL -Ptprcun Pepcb/BoyJ) à environ 6 à 10 semaines d’âge. Utilisez 564Igi (B6. Cg-Ightm1 (Igh564) TikIgktm1 (Igk564) Tik/J) et PA-GFP (donneurs de B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) aux 6-12 semaines d’âge. Stériliser les instruments chirurgicaux (tout droit des ciseaux et pinces Dumont #5 et #7) à l’autoclave eux conformément aux lignes directrices de stérilisation systématique. Préparer 500 mL de tampon de la moelle osseuse (BM) contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 2 % sérum bovin fœtal (SVF), l’acide éthylènediaminetétraacétique 1 mM (EDTA) à un pH de 7,4. Pour préparer le tampon de la BM, ajouter 10 mL d’inactivés par la chaleur (1 heure dans un bain d’eau de 56 ° C pour inactiver le complément) FBS et 1,25 mL d’une solution d’EDTA 400 mM (ajustée à pH 7,4) à 500 mL de PBS, pH 7,4 et bien mélanger. Filtrer le tampon à l’aide d’une fiole de filtre de 0,2 µm. Préparer 10 mL de tampon de lyse des globules rouges (gr) (155 mM NH4Cl, 12 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA) en diluant 1 mL d’un stock de 10 x à 10 mL de volume total avec l’eau de qualité réactif. Préparer 50 mL de PBS avec 5 mM EDTA, pH 7,4. 2. création de chimères de moelle épinière mixte Irradiation des bénéficiaires (jour 0) Placer les destinataires de la moelle osseuse CD45.1 dans un récipient approprié de l’irradiation et irradier avec 1 100 Rad dans un irradiateur gamma.Remarque : Les sources alternatives d’irradiation peuvent être utilisés. Quelle que soit la source, la dose/durée doit être optimisé pour obtenir l’effet maximal myéloablatif avec lésions tissulaires collatéraux minimes aux animaux. Positionner sur antibiotique eau ad libitum (1 mg de sulfadiazin et 0,2 mg de triméthoprime/mL d’eau potable). Extraction des os (1 jour) Anesthésier les donneurs de moelle osseuse de 564Igi par un flux continu d’isoflurane 4 % dans l’air et les euthanasier par dislocation cervicale. Vaporiser sur les bailleurs de fonds avec de l’éthanol et placez-les sur les coussinets chirurgicales stériles sous la hotte à flux. Continuer de travailler à maintenir des conditions stériles, à l’aide de matériel et tampons stériles. Pour extraire le fémur et le tibia, tout d’abord faire une incision autour de la cheville et s’étendent vers le haut jusqu’à la hanche en utilisant directement des ciseaux. À l’aide d’une pince robuste ou pouce et les doigts index, tirez la peau et au large de la jambe vers le corps. De la même façon de tirer la peau vers le bas et en dehors du pied. Éjecte les articulations du genou et la cheville en saisissant le gigot à la hanche et en tirant le pied avec force. Passez à briser la cheville mixte et retirer le pied vers le corps en tenant le tibia, dénudant ainsi les tendons et les muscles hors du tibia. Casser le genou conjointe pour libérer le tibia et de même retirer ceci vers le corps tout en maintenant sur le fémur, décapage ainsi les tendons et les muscles hors du fémur. Faire une incision à l’articulation de la hanche et couper les tendons, puis retirez le fémur de la douille de hanche. Répétez les étapes 2.2.2 – 2.2.4 pour le côté controlatéral. Nettoyez soigneusement les os en les frottant avec une serviette en papier grossier afin d’éliminer tous les muscle et du tissu conjonctif. Puis les rincer dans un tampon BM glacé avant de les transférer enfin aux frais tampon BM froid sur la glace à l’aide d’une paire de pinces Dumont #7. Répétez l’étape 2.2 pour les donneurs de PA-GFP.Remarque : Le nombre de cellules de moelle osseuse d’un donneur unique varie selon le sexe et l’âge. Dimensionner le nombre de donneurs selon les ratios souhaitée d’entrée la moelle osseuse et les numéros et le nombre de destinataires. Si les donateurs soient font rares, les membres antérieurs peuvent être inclus pour l’extraction de la moelle osseuse. Cela entraîne généralement un 1/3 à ½ supplémentaire des cellules provenant des membres postérieurs. En général, n’importe où de 50 millions de cellules peuvent être récupérés par les bailleurs de fonds, selon l’âge, le sexe, fond et si seulement hind ou postérieur et membres antérieurs sont inclus. Extraction de cellule de la moelle osseuse Préparer le mortier en rinçant dans un tampon BM glacé. Vider la mémoire tampon de rinçage et utilisez un pipeteur électrique avec une pipette sérologique de 10 mL pour ajouter 10 mL de tampon de BM glacée fraîche. Transférez les bailleurs de fonds 564Igi les os au mortier à l’aide d’une paire de pinces Dumont #7 et utiliser le pilon pour écraser et broyer les os pour libérer la moelle osseuse. Aspirer l’extrait de la moelle osseuse avec une pipette sérologique de 10 mL et passez-le à travers un tamis de cellule de 70 µm dans un tube de 50 mL sur la glace. Ajouter une supplémentaire 10 mL de tampon de BM glacée fraîche au mortier et répétez l’opération pour assurer un recouvrement complet des cellules. Prélever sur OS le mortier avec une serviette en papier, jeter de façon appropriée et rincer le mortier soigneusement avec l’éthanol à 70 %, suivi par le tampon de la BM. Répétez l’étape 2.3 pour le groupe de donneurs de moelle osseuse PA-GFP. Comptage des cellules de moelle osseuse À l’aide d’une micropipette, déposer une goutte contenant 40 µL de tampon de lyse RBC sur un morceau de film plastique paraffine. Inverser le tube de la moelle osseuse de 564Igi quelques fois et retirer un 10µl aliquote à l’aide d’une micropipette. Mélangez-le avec le 40 µL de chute de tampon de lyse RBC. Par la suite ajouter 50 µL de bleu Trypan (0,4 % en solution aqueuse) à la baisse. Charger immédiatement 10 µL du mélange qui en résulte dans un hémocytomètre Burker-Türk et comte sous le microscope. Calculer le nombre de cellules / mL, à l’aide de la 10 x facteur de dilution totale. Confirmer la viabilité cellulaire suffisante > 90 %. Répétez l’étape 2.4 pour le groupe de donneurs de moelle osseuse PA-GFP. Préparation des suspensions de donateurs Basé sur les chiffres obtenus à l’étape 2.4 et le nombre de destinataires, calculer le volume de moelle osseuse donneur de chacun des groupes de deux donateurs à mélanger dans le tube de mélange de donateurs.NOTE : par exemple, pour configurer un groupe de 1:2 564Igi:PA mixte-chimères GFP avec 6 CD45.1 destinataires : chaque bénéficiaire nécessite 20 x 106 donneur cellules au total, 1 partie 564Igi et 2 pièces de PA-GFP. Cela nécessite donc, 6 x 1/3 x 20 x 106 = 40 x 106 cellules du donneur 564Igi et 6 x 2/3 x 20 x 106 = 80 x 106 PA-GFP cellules du donneur. Mélanger les montants appropriés de moelle de donateurs PA-GFP et 564lgi dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger le mélange de la moelle osseuse à 200 x g et 4 ° C pendant 10 minutes à l’aide d’un rotor oscillant de seau. Éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon BM glacé à une densité de 1 x 108 cellules / mL. Transférer dans un tube de microcentrifuge rafraîchies 1,5 mL sur la glace. Reconstituer les destinataires de la moelle osseuse avec donneur de moelle Anesthésier les destinataires à l’aide d’induction avec un flux continu d’isoflurane 4 % dans l’air, suivi de maintenance à 3,75 %. Vérifier un plan adéquat de l’anesthésie en absence de réflexe d’orteil-pincement. Balayer soigneusement le tube contenant le mélange de la moelle osseuse pour assurer adéquate remise en suspension des cellules de moelle osseuse, puis aspirer 200 µL du mélange de la moelle osseuse (~ 20 x 106 cellules), dans un 0,3 mL, seringue à insuline de calibre 30. Placez le récipient sur son côté, étirez doucement la peau au-dessus et au-dessous de le œil à légèrement « le œil sur la pop » et insérer délicatement la pointe de la seringue environ à un angle de 30° à l’avant de l’orbite, en prenant soin d’éviter les yeux et les tissus avoisinants. Lorsque la pointe de l’aiguille se fait sentir au toucher l’OS soulignant l’orbite, se rétracter légèrement (~0.5 mm) et injecter lentement la moelle du donneur à l’aide d’une pression constante.Remarque : Il ne devrait y avoir aucun ne saignement, aucune fuite de fluide et aucune à renflement très mineur de le œil après injection. Retourner la souris à la cage avec de l’eau aux antibiotiques ad libitum et vérifier la récupération immédiate de la procédure. Répétez l’étape 2.6 pour chaque destinataire.NOTE : Injection dans la veine de la queue peut être utilisée en remplacement de l’injection de retroorbital avec des résultats similaires, cependant, dans nos mains c’est considérablement plus lent, qui peut poser problème lorsque vous travaillez avec de grands groupes de destinataires. Récupération des animaux anesthésiés directement sur la literie de petit diamètre doit être évitée car elle entraîne un risque d’aspiration et asphyxie Élimination de l’eau aux antibiotiques (jour 14) Retirer l’eau aux antibiotiques de la cage et remplacer par l’eau potable fraîche ordinaire. 3. contrôle de reconstitution réussie et en vérifiant le degré approprié de chimérisme (semaine 6) Retroorbital saignement des chimères et des contrôles Préparer les tubes de prélèvement sanguin par étiquetage 1,5 mL tubes de microcentrifuge selon les numéros des étiquettes destinataire oreille et ajouter 50 µL de PBS contenant 5 mM EDTA.NOTE : Inclure des contrôles appropriés pour PA-GFP, CD45.1 et CD45.2 et 9 11 (idiotype). Cela peut être fait en incluant 1 PA-GFP + souris, 1 CD45.1 souris, 1 souris B6 et 1 souris 564Igi. D’offrir une souris et vérifier le plan adéquat d’anesthésie comme à l’étape 2.6.1. Placez la chimère de son côté, étirez doucement la peau au-dessus et au-dessous de le œil à légèrement « le œil sur la pop ». Insérer délicatement un tube capillaire hépariné BoPET gainé (volume intérieur de 60 µL) environ à un angle de 40° à l’avant de l’orbite, en prenant soin de ne pas endommager l’oeil et le tissu environnant. Twist/tourner doucement le tube jusqu’à ce qu’il commence à se remplir de sang. Permettre au sang de remplir passivement le tube par capillarité, jusqu’à ce que presque complètement plein, puis retirer le tube et le placer dans le tube de prélèvement préétiquetés correspondant, tout en même temps relaxant immédiatement la poignée autour de le œil afin de permettre à le œil régler en position. Un saignement devrait arrêter immédiatement. S’assurer que le tube capillaire a vidé dans le tube de prélèvement et le jeter dans un conteneur d’objets coupants. Fermer le tube et renverser trois fois pour assurer le mélange complet avec le PBS/EDTA. Retourner la souris à la cage et vérifier la récupération immédiate de la procédure. Répétez l’étape 3.1 pour chaque souris expérimentales et les contrôles appropriés.Remarque : Prendre des précautions lorsque vous utilisez la ponction de la veine sous-maxillaire car cette méthode peut-être comporter un risque accru d’infection accidentelle chez les receveurs irradiés avant que ceux-ci sont entièrement reconstitués. En outre, d’après notre expérience, nous trouvons que le volume de sang prélevé et la quantité de sang perdue en raison de saignements excessifs est plus variable. Deux de ces considérations sont importantes, comme les chimères de moelle osseuse sont sensibles à la phase de reconstitution, avant que la nouvelle moelle osseuse est entièrement implantée et hématopoïèse a repris des niveaux normaux. Purification de cellules mononucléaires (PBMC) de sang périphérique Après la fin de la collecte de sang, brièvement (10 s) centrifuger les tubes à basse vitesse (< x 200 g) pour recueillir les dilués stabilisé sang au fond des tubes. Remplir une seringue de 10 mL de milieu de séparation de lymphocytes et attachez une aiguille 18 G. Insérer l’aiguille vers le bas du premier tube et underlayer l’échantillon de sang avec 1 mL de milieu de séparation de lymphocytes. Avec précaution, retirer l’aiguille et l’essuyer avec un essuie-tout pour empêcher la contamination croisée de l’échantillon suivant. Continuez à travers tous les échantillons, puis centrifuger pendant 25 minutes à 800 x g, à température ambiante, dans une centrifugeuse de balancer-seau, avec les freins mis à faible/arrêt. Préparer un ensemble de conséquence marqué 1,5 mL microtubes à centrifuger contenant 1 mL de tampon de BM glacee chaque. Après centrifugation, pour chaque échantillon, entrer dans la couche supérieure (plasma), avec une micropipette 200 µL et aspirer la couche de cellules mononucléées (RNM) juste au-dessus de l’interface. Transférer les cellules dans le tube autant étiqueté contenant 1 mL de tampon de la BM. Fermer le couvercle et renverser pour mélanger. Jeter le tube contenant du milieu de séparation lymphocytes. Aller de l’avant par le biais de tous les échantillons et puis centrifuger à 200 x g pendant 5 min, 4 ° C dans un rotor oscillant de seau. Aspirer et éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 200 µL de tampon de BM glacée. Les échantillons sont maintenant prêts pour la coloration à l’anticorps et de l’analyse en cytométrie en flux. Coloration pour l’évaluation de cytométrie en fluxNOTE : A suggéré de panneau : CD45.1-FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9d 11-A568, CD45.2-APC. Non activé PA-GFP est détectée dans le canal du Pacifique d’Orange (ou équivalent). Aucun colorant de viabilité n’est nécessaire car la séparation de lymphocytes se débarrasse des cellules mortes. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 µL de la suspension de cellules / puits pour chaque échantillon de chimère et de contrôle, sur une plaque de 96 puits. Pour les 3 échantillons non-PA-GFP contrôle, mettre en commun les restants de 100 µL de chaque échantillon (total 300 µL). Ajouter 50 µL de ce matériel pour le contrôle non coloré et puits monocommande tachées. Pour le contrôle de coloration unique PA-GFP en outre ajouter 50 µL de l’échantillon de PA-GFP non coloré. Dans chaque puits, ajouter 100 µL de tampon (non souillées enregistré), avec un anticorps (contrôles de compensation unique teinté, à l’exception de la commande de compensation de PA-GFP) ou mélange d’anticorps (échantillons). Incuber sur glace pendant 20 minutes. Centrifuger à 200 x g pendant 5 minutes à 4 ° C. Film sur la mémoire tampon. Ajouter 200 µL de tampon de la BM à chaque puits et centrifuger à nouveau pour se laver. Glissement sur le tampon et remettre en suspension des cellules dans chaque puits dans 200 µL de tampon de la BM. Les échantillons sont maintenant prêts pour l’analyse sur un cytomètre de flux (Figure 1).Remarque : Les réponses de centre germinatif dans les chimères peuvent être analysés à n’importe quel point de 6 semaines à partir. 4. In vivo d’étiquetage du sinus marginal zone/sous-capsulaire pour faciliter l’identification des centres germinatifs unique Remarque : Le présent protocole est démontré pour coussinet plantaire/jarret (ganglion poplitée) et les injections intraveineuse (i.v., rate), mais peut varier selon le site cible. Injection de coussinet plantaire bilatérale pour l’étiquetage des ganglions poplitées Anesthésier les souris comme dans l’étape 2.6.1. Dans un tube de microtubes de 1,5 mL, diluer 2 µL de rat marqués au PE de CD169 anticorps anti-souris dans 18 µL de PBS, pH 7,4. Placez deux gouttelettes de 10 µL de chaque du mélange sur un morceau de film plastique paraffine. Aspirez chaque goutte à l’aide d’une seringue à insuline 0,3 mL avec une aiguille de 30 calibre. Injecter le 10 µL d’étiquetage mix soit dans le coussinet plantaire (Entrez avec l’aiguille à un angle de 5-10° dans la partie centrale de la pad, proximale depuis le début des orteils et insérez l’aiguille environ à mi-chemin vers le talon) ou le jarret (entrer avec l’aiguille à un 5 – 10 ° d’angle juste au-dessus du talon et insérer autour à mi-chemin de son parcours le long de l’axe du tendon d’Achille dans la direction vers le genou). Retourner les souris à leurs cages et attendre environ 15 minutes avant de procéder à l’étape 5. Injection intraveineuse pour l’étiquetage de la rate Anesthésier les souris comme point 2.6.1. Dans un tube de microtubes de 1,5 mL, diluer 10 µL d’anticorps marqués au PE rat anti-souris CD169 90 µL de PBS. Aspirer le mélange avec une seringue à insuline 0,3 mL. Effectuer l’injection i.v. retroorbital comme par l’Etape 2.6. Retourner les souris à leurs cages et attendre environ 15 minutes avant de procéder à l’étape 5.Remarque : comme alternative à l’isoflurane, injection anesthésique comme mélange de kétamine/Xylazine peut être utilisé ; Toutefois, cela conduit généralement à des temps de récupération plus lentes. Étant donné que le drainage lymphatique est généralement influencé par le mouvement des muscles squelettiques, cela devrait conduire à des temps de drainage plus lent. 5. précisant la rate et les ganglions lymphatiques et la préparation de photoactivation Préparer une chambre d’imagerie et de photoactivation recto-verso Retirez le piston d’une seringue de 20 mL et charger arrière il avec de la graisse sous vide en y insérant la buse d’un tube de graisse sous vide. Puis retirez le piston d’une seringue de 5 mL et utilisez la seringue de 20 mL pour dos-charge avec de la graisse sous vide. La seringue vide-graisse chargé 5 mL permet de préparer une imagerie et chambre de photoactivation en plaçant une lamelle carrée sur une surface plane et en traçant le long des bords de la lamelle couvre-objet avec de la graisse sous vide (environ 1-2 mm des bords).Remarque : veiller à éviter la contamination de graisse sous vide de toutes les surfaces qui par la suite entrer en contact avec la lentille du microscope, comme les gouttelettes de graisse vide émulsifié dans l’eau d’immersion peuvent contaminer les lentilles. Remplir la chambre d’aspiration graisse lamelle couvre-objet avec un tampon BM glacée et placer sur une surface plate froide. Récolte des ganglions lymphatiques et la rate Euthanasier l’in vivo étiqueté souris chimérique à analyser comme par l’Etape 2.2.1. Vaporiser vers le bas de la carcasse à l’éthanol 70 %. Pour accéder au nœud de ganglions poplité, utilisez directement des ciseaux pour faire une incision dans la peau juste en dessous de la fosse du genou et d’étendre la coupe vers le haut le long de la ligne ischio-jambiers presque jusqu’à l’articulation de la hanche. À l’aide de Dumont #5 ou #7 pince, tirez chacun des volets exposées de peau vers l’extérieur, pour exposer le tissu dans le creux poplité (Figure 2 a). À l’aide d’une paire de pinces Dumont #5, soigneusement entrer du creux poplité juste médial de la veine poplitée et disséquer ouvrir la graisse en insérant et en ouvrant et en fermant la pince sur l’axe de la jambe, afin d’exposer le ganglion poplité sous-jacent. Pop le ganglion hors de la fosse en pinçant le muscle quadriceps de la face proximale du genou en utilisant le pouce et l’index (Figure 2 b). Prenez le ganglion lymphatique par en dessous avec la pince à libérer des tissus environnants (Figure 2) et puis placez-le dans la chambre d’aspiration graisse préparée à l’étape 5.1. Répétez les étapes 5.2.2 – 5.2.4 pour le côté controlatéral. Plusieurs ganglions lymphatiques peut être montés dans une seule chambre si vous le souhaitez. Enfin, fermer la chambre en plaçant une seconde lamelle sur le dessus de la jante de la graisse sous vide et en appuyant légèrement vers le bas, en prenant soin d’extruder toutes les bulles d’air.Remarque : La mémoire tampon peut être éliminée aussi bien, mais la graisse sous vide doit former un joint étanche, empêchant les fuites de fluide (Figure 2D). Les ganglions lymphatiques sont maintenant dans une chambre d’imagerie recto-verso. Pour accéder à la rate, en utilisant une paire de faire directement des ciseaux, une incision à travers la paroi abdominale sur le côté gauche de la souris, proximale à la ligne médiane antérieure, juste en dessous de la cage thoracique et l’étendre autour du corps de la ligne axillaire postérieure. La pointe de la rate est visible (Figure 3 a). Retirer la rate avec une paire de pinces Dumont #7 et couper les adhérences sur le dessous pour le libérer. Utiliser la paire de ciseaux tout droit fines pour couper ~ 2 mm épais, transversales, tranches. Placer la tranche dans la chambre d’aspiration graisse préparée à l’étape 5.1. Plusieurs sections de la rate peuvent être montées dans une seule chambre si vous le souhaitez. Enfin, fermer la chambre en plaçant une seconde lamelle sur le dessus de la jante de la graisse sous vide et en appuyant légèrement vers le bas, en prenant soin d’extruder toutes les bulles d’air. Garder tous les chambres d’imagerie sur glace en tout temps, à l’exception des durant l’imagerie et la photoactivation.Remarque : La mémoire tampon peut être éliminée aussi bien, mais la graisse sous vide doit former un joint étanche, empêchant les fuites de fluide. Les tranches de la rate sont maintenant dans une chambre d’imagerie recto-verso (Figure 3 b). 6. Photoactivation Identifiant unique centres germinauxRemarque : Ce protocole est décrit pour la rate, mais il est tout à fait analogue pour les ganglions lymphatiques. Placez la chambre d’imagerie sur la platine du microscope. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique de 3,5 mL, déposez une goutte d’eau distillée sur le dessus de la lamelle supérieure et abaissez l’objectif jusqu’à ce que le point de contact. Mettre l’accent sur le dessus du tissu à l’aide de la lumière transmise. Basculez en mode dark et excitation à deux photons et régler le laser à 940 nm.Remarque : Avec les jeux de filtres appropriés, cette longueur d’onde permet d’excitation et détection de deuxième génération d’harmoniques dans les structures contenant du collagène associées aux principaux vaisseaux et les éléments structuraux, ainsi que le CD169-PE injecté à l’étape 4.2, qui identifie la zone marginale. Toutefois, une excitation 940 nm ne pas photoactivate PA-GFP. Localiser les zones de blanc-pâte individuelles (délimitées par une coloration CD169-PE) près de la surface du tissu et identifier la gaine lymphoïdes periarteriolar (PALS, zone de lymphocytes T) par la seconde génération d’harmoniques associée à l’artériole centrale. Dans la zone entre le copains et la zone marginale, recherchez la présence de hautement auto-fluorescente, activé macrophages colorables-corps (signal auto-fluorescente forte dans tous les canaux, blob-comme l’aspect avec les vacuoles foncés) (Figure 4 a).Remarque : Si nécessaire, en raison de l’orientation indésirable du tissu, la chambre d’imagerie peut être retournée et imagerie peut être effectuée depuis l’autre sens. Issu des poinçons identifiées à l’étape 6.1.3., dessiner une région d’intérêt identifier un domaine unique centre germinatif. Mettre en place une Z-pile d’autour de 100-150 µm profondeur, à partir de la surface du tissu et en utilisant une taille de step de ~ 3 µm. Passer à la longueur d’onde de 830 nm excitation. Arrête ou dim tous les canaux afin d’éviter le photovieillissement aux détecteurs (comme puissance de laser et sortie fluorescence est généralement considérablement plus élevé à cette longueur d’onde) et puis « image » de la pile.Remarque : Les paramètres spécifiques, tels que les temps de pause de pixel et de la puissance laser, dépendent de la profondeur dans le tissu, le tissu spécifique utilisé et le système d’imagerie. Chaque demande doit être optimisé pour le système d’imagerie spécifique utilisé. S’il est essentiel d’obtenir la photoactivation efficace tout au long de la pile, il faut pas de photovieillissement les cellules. Revenez à la longueur d’onde de 940 nm excitation et rouvrir les canaux. Parcourir la pile pour confirmer la photoactivation efficace tout au long de la (Figure 4 b) et absence de photovieillissement (signal PA-GFP diffuse, non-cellule-délimitée, taches foncées ou haut-degré autofluorescence dans zone de photoactivation). Passez à photoactivate tous les tissus dans la chambre de l’imagerie, puis retourner rapidement à la glace jusqu’à ce que la poursuite de la procédure. Procéder à la photoactivation de chambres de complément d’imagerie.NOTE : Tissu précisant, montage et en particulier de photoactivation sont des processus fastidieux, mais le temps de rotation totale devrait être limité à 4 à 6 heures, afin d’éviter une diminution dramatique de la viabilité cellulaire. 7. récupération et l’analyse des cellules de photoactivation Extraction des lymphocytes des ganglions lymphatiques et la rate Pour chaque échantillon de photoactivation, préparer un tube de microcentrifuge étiquetés en conséquence de 1,5 mL contenant 500 µL de tampon de la BM sur la glace. Inclure des échantillons d’un contrôle non-PA-GFP et une souris de PA-GFP non activé. Ceci peut être accompli en incluant un contrôle de B6 et une PA-GFP contrôle de la souris. Retirer délicatement la lamelle supérieure de la chambre d’imagerie, en prenant soin de maintenir la position des échantillons (si plusieurs échantillons sont présents dans une seule chambre) et placer chaque échantillon dans son tube à essais respectifs. À l’aide d’un homogénéisateur pilon, appuyer sur le tissu et tourner le pilon dans le tube pour libérer les lymphocytes. À l’aide d’une micropipette, aspirer le lysat et filtrer à travers un tamis de cellule de 70 µm dans un tube de microcentrifuge fraîches, un refroidissement préalable de 1,5 mL. Pour les échantillons de ganglion lymphatique, passez à l’étape 7.1.5. Pour les échantillons de rate, centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 ° C dans un rotor oscillant de seau. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 200 µL de tampon de lyse de RBC. Incuber 5 min à température ambiante, puis ajouter 800 µL de tampon de BM glacée et passez à l’étape 7.1.5. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 ° C dans un rotor oscillant de seau. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 200 µL de tampon de BM glacée. Les échantillons sont maintenant prêts pour coloration pour l’évaluation de cytométrie en flux et tri, si vous le souhaitez. Coloration pour l’évaluation de cytométrie en fluxNOTE : A suggéré de panneau : CD169-PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9d 11-A647, CD38-PE-Cy7, Fixable viabilité colorant Efluor-780, GL7-Pacific Blue. Non activé PA-GFP est détectée dans le canal du Pacifique d’Orange (ou équivalent). Photoactivated PA-GFP est détectée dans le canal GFP. Les macrophages co purifiés (qui peuvent ou peuvent pas in vivo étiqueté avec CD169-PE) peuvent être exclus par coloration avec CD169-PE et utiliser cela comme une porte de décharge. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 µL de la suspension de cellules / puits pour chaque échantillon de chimère et de contrôle, dans une plaque à 96 puits. Pour les échantillons de contrôle B6, ajouter 50 µL de ce matériel pour le contrôle non coloré et puits monocommande tachées. Pour le contrôle non-activé de coloration unique PA-GFP en outre ajouter 50 µL de l’échantillon de PA-GFP incolores non activé. Pour le contrôle de coloration unique activé PA-GFP, mettre en commun les matières restantes pour tous les échantillons de photoactivation. Dans chaque puits, ajouter 100 µL de tampon (non souillées enregistré et compensation de PA-GFP contrôle), avec un anticorps (contrôles de compensation unique teinté) ou mélange d’anticorps (photoactivation échantillons). Incuber sur glace pendant 20 minutes. Centrifuger à 200 g 5 minutes à 4 ° C. Film sur la mémoire tampon. Ajouter 200 µL de tampon de la BM à chaque puits et centrifuger à nouveau pour se laver. Glissement sur le tampon et remettre en suspension des cellules dans chaque puits dans 200 µL de tampon de la BM. Les échantillons sont maintenant prêts pour l’analyse sur un cytomètre en flux ou trieur (résultats représentatifs dans la Figure 5).