مراكز استجواب جيرمنال أوتوريكتيفي الفردية بواسطة فوتواكتيفيشن في نموذج تشيميريك مختلط من المناعة الذاتية
Summary
ويصف هذا البروتوكول توليد التركيبات نخاع العظام مورين مختلطة مع عفوية مراكز جيرمنال المناعة الذاتية، وفي أوتوريكتيفي التي تحمل لمفاوية مراسل فوتواكتيفاتابل البروتينات فلورية خضراء (السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل). وهذا يوفر القدرة على ربط موقع الهاتف الخلوي في الأنسجة مع التحليلات الجزيئية ووظيفية المتلقين للمعلومات.
Abstract
أمراض المناعة الذاتية الحالي عبئا صحية كبيرة. أسئلة أساسية تتعلق بالتنمية والتقدم لأمراض المناعة الذاتية لا تزال دون إجابة. شرط واحد للتقدم في فهمنا للآليات المرض الكامنة وديناميات الخلوية هو اقتران دقيقة من موقع ميكرواناتوميكال لمجموعات فرعية الخلية مع التحليلات الجزيئية أو وظيفية المتلقين للمعلومات؛ هدفا تقليديا يصعب تحقيقه. تمكين وضع fluorophores البيولوجية فوتواكتيفاتابل مستقرة واندماجها في سلالات مراسل مؤخرا وسم ميكرواناتوميكال دقيقة وتتبع من المجموعات الخلوية في نماذج مورين. هنا، نحن تصف كيفية القدرة على تحليل الخلايا اللمفية أوتوريكتيفي من مراكز جيرمنال واحد قد تساعد على تقديم رؤى جديدة في المناعة الذاتية، باستخدام المزيج من طراز تشيميريك الرواية من المناعة الذاتية مع مراسل فوتواكتيفاتابل كمثال . علينا أن نظهر مختلطة إجراء لتوليد التركيبات مع أوتوريكتيفي عفوية جيرمنال المراكز المأهولة لمفاوية تحمل مراسل بروتين فلوري أخضر فوتواكتيفاتابل. استخدام استراتيجيات التوسيم في الحية، يمكن تصور واحد مراكز جيرمنال في الأنسجة اللمفاوية اكسبلانتيد وعلى فوتواكتيفاتيد المكونات الخلوية قبل يومين-فوتون مجهرية. لمفاوية فوتواكتيفاتيد من مراكز جيرمنال واحد يمكن تحليلها ثم أو فرز تدفق سيتوميتريكالي، كخلايا مفردة أو بكميات كبيرة، ويمكن أن يتعرضوا للتحاليل الجزيئية ووظيفية المتلقين للمعلومات الإضافية. مباشرة يمكن تطبيق هذا النهج على تقديم أفكار متجددة في مجال المناعة الذاتية، ولكن قد تجد الإجراء الخاص بتوليد التركيبات نخاع العظام والإجراء فوتواكتيفيشن بالإضافة إلى ذلك تطبيق واسع في الدراسات المتعلقة بالأمراض المعدية و ورم الانبثاث.
Introduction
حدوث أمراض المناعة الذاتية قد ارتفعت بسرعة في العقود الماضية، وبخاصة في المجتمعات الغربية. واليوم، أمراض المناعة الذاتية في صفوف الثالث على قائمة الأسباب الأكثر شيوعاً للإصابة بالأمراض ومعدلات الوفيات في العالم الغربي1. أسئلة أساسية تتعلق بالتنمية والتقدم لأمراض المناعة الذاتية لا تزال دون إجابة. شرط واحد للتقدم في فهمنا للآليات المرض الكامنة وديناميات الخلوية هو اقتران دقيقة من موقع ميكرواناتوميكال لمجموعات فرعية الخلية مع التحليلات الجزيئية أو وظيفية المتلقين للمعلومات. في العقد الماضي، قد مكن تطوير عدد من مستقرة fluorophores البيولوجي فوتوكونفيرتيبلي، أو فوتواكتيفاتابل، أو فوتوسويتشابل واندماجها في سلالات مراسل وسم ميكرواناتوميكال دقيقة وتتبع الخلوي مجموعات فرعية في نماذج مورين.
كايد، بروتين فلوري فوتوكونفيرتيبلي التي تنشأ من المرجان ستوني، يخضع فوتوكونفيرسيون لا رجعة فيه من الأسفار الخضراء للأسفار الأحمر عند التعرض ل الضوء فوق البنفسجي أو الأشعة فوق البنفسجية2. في البداية يعملون على اتباع السلوك الديناميكي للخلايا الفردية في تطوير أورجانوتيبيك الدماغ شرائح3، جيل كايد خبط في الماوس يسمح فيما بعد رصد الحركة الخلوية الحية في، والنظام تم تطبيقها على تحليلات الخلايا المناعية الهجرة من وإلى العقد الليمفاوية4. وكان هذا النهج المكرر في وقت لاحق مع مراسل من الجيل الثاني5. مراسل مماثلة هو ديندرا6، التي استخدمت مؤخرا لتعقب الانبثاث العقدة الليمفاوية في فيفو7.
وكان البروتين فوتواكتيفاتابل الأولى وضعت أخضر فلورسنت بروتين (بروتينات فلورية خضراء) هندسيا مع طفرة نقطة واحدة (T203H)، مما أدى إلى امتصاص منخفضة جداً في منطقة الطول الموجي من 450 إلى 550 نيوتن متر8. بعد فوتواكتيفيشن بالضوء فوق البنفسجي، يبدل هذا البروتين فوتواكتيفاتابل أخضر نيون (السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل) استيعاب الحد الأقصى من 400 ~ إلى ~ 500 نانومتر، تسفر عن كثافة 100-fold تقريبية زيادة عندما متحمس مع طول موجه 488 نانومتر. يسمح توليد الفئران المعدلة وراثيا التي أعرب جميع الخلايا المكونة للدم السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، للمرة الأولى، تحليلات متعمقة لتحديد الخلية بفي مناطق الضوء والظلام تشريحيا محددة من مركز جيرمنال9.
حين فوتواكتيفيشن تحويل الذي لا رجعة فيه من دولة غير الفلورية إلى دولة فلورسنت، وفوتوكونفيرسيون انتقال ذهابا من طول موجي واحد إلى آخر، البروتينات فوتوسويتشابل قادرون على رحلات مكوكية بين كلا الشرطين10 . كان تسخير هذه الصفة الأخيرة مؤخرا لهندسة التحكم الضوئية ل نشاط البروتين11.
استخدام المراسل السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، ونحن مؤخرا تتميز مبدع الخلية بواحد مراكز جيرمنال في نموذج رواية للمناعة الذاتية مثل الذئبة عفوية12. يستند هذا النموذج إلى التركيبات المختلطة مع نخاع العظام جزء 1 إيواء أوتوريكتيفي خلية بمستقبﻻت طريقة الكبس مع خصوصية لمجمعات ريبونوكلير بالبروتين (564Igi،من13،14) جنبا إلى جنب مع نخاع العظام 2 أجزاء من أي المطلوب المانحة. في حوالي 6 أسابيع بعد إعادة تشكيل، تتحقق شروط التماثل الساكن في أوتوريكتيفي العفوية التي جيرمنال المراكز موجودة في الطحال والعقد اللمفاوية الجلدية. جدير بالذكر أن مركز جيرمنال السكان بخليه حصرا تقريبا (~ 95 ٪) تتألف من الخلايا المشتقة من حجرة غير 564Igi، وأصبحت هذه الخلايا المستمدة من النوع المتوحش ب أوتوريكتيفي. ولذلك، يسمح النموذج نهج ‘التوصيل والتشغيل’ إلى تحليلات لمركز جيرمنال أوتوريكتيفي ب الخلايا باستخدام مختلف المتسلسلات وطرق الرافضة والصحفيين. هنا، يمكننا وصف الإجراء لتوليد التركيبات المختلطة مع مراكز جيرمنال أوتوريكتيفي عفوية يسكنها لمفاوية تحمل المراسل السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل. استخدام استراتيجيات التوسيم في الحية، يمكن تصور واحد مراكز جيرمنال في الأنسجة اللمفاوية اكسبلانتيد وفوتواكتيفاتيد المكونات الخلوية استخدام مجهر اثنين-فوتون. لمفاوية فوتواكتيفاتيد من مراكز جيرمنال واحدة يمكن فيما بعد تحليلها بواسطة التدفق الخلوي أو فرز حسب فلوروتشرومي تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) وتعرض للتحاليل الجزيئية ووظيفية المتلقين للمعلومات الإضافية. القدرة على تحليل الخلايا اللمفية أوتوريكتيفي من مراكز جيرمنال واحدة مباشرة يمكن تطبيقها على تقديم أفكار متجددة في مجال المناعة الذاتية، ولكن التقنيات والنهج الموصوفة بالإضافة إلى ذلك قد تجد التطبيقات ذات الصلة في دراسات الأمراض المعدية والورم الانبثاث.
Protocol
Representative Results
Discussion
عدد كبير من نماذج مورين من المناعة الذاتية متاحة، والكثير منها يقدم مع مراكز جيرمنال عفوية16. ومع ذلك، العديد من النماذج المتاحة المرفأ الخلفيات الوراثية المعقدة أو الطفرات في المنظمين وسط انتشار الخلايا اللمفاوية أو التنشيط، مما يجعلها ضعيفة تلائم إينتيركروسينج مع خطوط مراسل والدراسات المتعلقة بالسلوك العادي اللمفاويات في المناعة الذاتية، على التوالي. النموذج الحالي، على العكس من ذلك، يسمح نهج ‘التوصيل والتشغيل’ إلى تحليلات متعمقة للخلايا المستمدة من النوع المتوحش مركز جيرمنال ب أوتوريكتيفي استخدام أي مزيج المرجوة المتسلسلات وطرق الرافضة والصحفيين، في هذه القضية التي يمثلها فوتواكتيفاتابل التجارة والنقل. استخدام استراتيجيات التوسيم في الحية، يمكن تصور واحد مراكز جيرمنال في الأنسجة اللمفاوية اكسبلانتيد وفوتواكتيفاتيد المكونات الخلوية استخدام مجهر اثنين-فوتون. ثم يمكن لمفاوية فوتواكتيفاتيد من مراكز جيرمنال واحد سيتوميتريكالي تدفق فرزها أو تحليلها، كخلايا مفردة أو بكميات كبيرة. قد تتعرض هذه الخلايا فيما بعد للتحاليل الجزيئية والوظيفية المتلقين للمعلومات الإضافية لتقديم أفكار متجددة في مجال المناعة الذاتية.
وهناك بعض الخطوات الحاسمة للأداء الناجح لهذا الإجراء. كما يتبين من نتائج تمثيلية، التشعيع (1,100 راد) والجهات المانحة نخاع العظم إعادة تشكيل بنجاح استبدال حجرة نخاع العظام المتلقية الغلة تشيميريسم شبه كاملة في حجرة الخلية ب. هذا نقطة هامة، كما سيجعل الخلايا ب المستمدة من المستلم المتبقية مجموعة فرعية من السكان مركز جيرمنال ‘الظلام’. بغض النظر عن المصدر المستخدمة التشعيع، الجرعة/توقيت تشعيع له ليكون الأمثل تسفر عن تأثير ميلوابلاتيفي القصوى مع تلف الأنسجة الجانبية الحد الأدنى للحيوانات. لإعادة تشكيل، قد وجد بروتوكول سحق العظام وإعادة تشكيل مع 20 مليون مجموع المانحين الخلايا تحقق درجة عالية من إعادة تشكيل قوة. يضمن إمكانية عالية للجهة المانحة نخاع العامل العقيمة والباردة على الجليد لاستخراج نخاع العظام. للوصول إلى الجهة المانحة المطلوب نسب نخاع العظام، من الضروري الحذر الشديد عند عد مختبرين للخلايا، لعد نفسها وعند أخذ العينة الفرعية لنخاع العظام للعد. خلط وشارك التكوير الكوسا المانحين، بدلاً من سينتريفوجينج وريسوسبيندينج بشكل منفصل وثم خلط، يعمل لمنع أي انحراف في نسب المانحة بعد عد الخلايا.
توليد الوهم نخاع العظام المختلطة من البروتوكول يمكن أن تقف وحدها، وأنه يمكن توليد التركيبات مع مراكز جيرمنال أوتوريكتيفي مع أي مراسل المرجوة، أو التحوير، أو المغلوب. غير حد واحد لهذه الحاجة إلى الاستعانة بالجهات المانحة هيستوكومباتيبلي. سلالة 564Igi على خلفية كونجينيك C57Bl/6J، ونتيجة لذلك، ينبغي أن يكون الجهة أو الجهات المانحة الأخرى والمستفيدين خلفية كونجينيك حاء-2b (أو بدلاً من ذلك، ينبغي أن باككروسيد سلالة 564Igi إلى الضغط المطلوب والنمط الظاهري المناعة الذاتية يتم التحقق على خلفية جديدة). الإجراء تشعيع يميل لصالح بيئة توليروجينيك17، وقد يسمح بعدم التطابق في بعض المستضدات histocompatibility طفيفة. إلا أن هذا الجانب ينبغي دقة النظر، لا سيما إذا خلط الذكور والإناث الجهات المانحة و/أو المستفيدين، نظراً لاحتمال مفاعليه الإناث مع المستضدات Y مقيدة بذكر.
وبالمثل، الجانب فوتواكتيفيشن البروتوكول يمكن أن تقف وحدها، ويمكن استخدامها في العديد من السياقات المختلفة. ومع ذلك، المراسل السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل الوحيدة المتاحة حاليا مع مروج جامعة كولومبيا البريطانية، ونشطة في جميع الخلايا النسب المكونة للدم، ولكن ليس في الخلايا اللحمية. كما ذكر في المقدمة، فوتواكتيفاتابل، فوتوسويتشابل أو فوتوكونفيرتيبلي مراسل سلالات أخرى متوفرة، ويمكن الاستعاضة عن السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، مع التعديل المناسب للظروف التجريبية.
من المهم تجنب فوتواكتيفيشن غير مقصود من المناطق غير المرغوب فيها، بالاحتفاظ بالليزر فوق 900 نانومتر عند التصوير، وهذا الطول الموجي وسوف لا فوتواكتيفاتي السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل. فوتواكتيفيشن نفسها، إعدادات معينة، مثل الليزر بكسل والسلطة الوقت يسكن، سيعتمد على العمق في الأنسجة والأنسجة محددة تستخدم نظام التصوير، وكل التطبيق الأمثل لنظام التصوير المحددة المستخدمة. ينبغي أن يكون الحرص عدم د الخلايا، إلا أنها في الوقت نفسه ضرورية للحصول على كفاءة فوتواكتيفيشن في جميع أنحاء المكدس، من أجل الحصول على تمثيل كاف لتنشيط الخلايا لتحليلات المتلقين للمعلومات. مركز جيرمنال ب الخلايا عموما تشكل في أي مكان من 0.5% ~ 2% من خلايا الطحال أو الجلدية العقدة الليمفاوية ب، وكما يتبين من نتائج الممثل (الشكل 5)، فوتواكتيفاتيد واحدة في الوسط جيرمنال ب الخلايا قد جعل ~ 1 في المائة من مجموع عدد السكان الحالي في شريحة مفردة طحال. ولذلك، فرز عدد كبير من الخلايا أو التحليل الناجح يتطلب تجهيز عدد كبير من الأحداث.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
دغن سراج الدين هو زميل لوندبيكفوندين وزميل مؤسسة كارلسبرغ الموقر. وأيد هذا العمل بالإضافة إلى ذلك في الجزء على “منحة نف الطب الحيوي” (دغن سراج الدين).
Materials
| Antibody, 9D11-A568 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255 | |
| Antibody, 9D11-A647 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031 | |
| Antibody, FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | 110705 | |
| Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker) | Biolegend | 144613 | |
| Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1) | Biolegend | 142403 | |
| Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38 | Biolegend | 102717 | |
| Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 | Biolegend | 103235 | |
| Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized | Fisher Scientific | 211766 | |
| Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
| Conical tubes, 50 mL | Falcon | 352235 | |
| Cover slip, square, 22×22 mm, 0.13-0.17 mm | Thermo Fisher Scientific | 22X22-1 | |
| EDTA | Merck | 1,084,180,250 | |
| Ethanol, 70% | VWR | 8301.360 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
| Flow cytometer, FACS Canto II | BD Biosciences | 338962 | |
| Flow cytometer, LSRFortessa SORP | BD Biosciences | – | Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm) |
| Grease, high vacuum, Dow Corning | VWR | DOWC1597418 | |
| Hemocytometer, Burker-Türk | VWR | 630-1544 | |
| Isoflurane, IsoFlo vet. | Orion Pharma | 9658 | |
| Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media) | Cedarlane | CL5035 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf) | Sarstedt | 72.690.550 | |
| Microscope, Two-photon | Prairie Technologies (now Bruker) | – | Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope |
| Mortar w. lip, unglazed, 75 ml | VWR | 410-0110 | |
| NaHCO3 | Merck | 1063290500 | |
| Needle, 18 gauge | BD Medical | 304622 | |
| NH4Cl | VWR | 87,769,290 | |
| PBS | Sigma | d8537 | |
| Pestle homogenizer | VWR | 47747-358 | |
| Pestle, unglazed, 175 mm | VWR | 410-0122 | |
| Pipette, Serological, 10 ml | VWR | 612-3700 | |
| Pipette, transfer, plastic | Sarstedt | 861,172,001 | |
| Plastic paraffin film (Parafilm M) | Bemis | PM996 | |
| Plate, 96-well | Falcon | 353910 | |
| Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps | FST – Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps | FST – Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight | FST – Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ES1 | |
| Syringe, 20 mL | Terumo | SS-20ES1 | |
| Syringe, 5 mL | Terumo | SS-05S1 | |
| Syringe, Insulin, 0.3 cc | BD Medical | 324827 | |
| Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml | MSD Animal health | 431577 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | VWR | K940-100ML | |
| Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 |
Riferimenti
- Lerner, A., Jeremias, P., Matthias, T. The World Incidence and Prevalence of Autoimmune Diseases is Increasing. International Journal of Celiac Disease. 3 (4), 151-155 (2015).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Mutoh, T., Miyata, T., Kashiwagi, S., Miyawaki, A., Ogawa, M. Dynamic behavior of individual cells in developing organotypic brain slices revealed by the photoconvertable protein Kaede. Experimental neurology. 200 (2), 430-437 (2006).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10871-10876 (2008).
- Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science (New York, NY). 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, NY). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Habuchi, S., et al. Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9511-9516 (2005).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science (New York, NY). 338 (6108), 810-814 (2012).
- Degn, S. E., et al. Clonal Evolution of Autoreactive Germinal Centers. Cell. 170 (5), 913-926 (2017).
- Berland, R., et al. Toll-like receptor 7-dependent loss of B cell tolerance in pathogenic autoantibody knockin mice. Immunity. 25 (3), 429-440 (2006).
- Chatterjee, P., et al. Complement C4 maintains peripheral B-cell tolerance in a myeloid cell dependent manner. European journal of immunology. 43 (9), 2441-2450 (2013).
- Toubai, T., et al. Induction of acute GVHD by sex-mismatched H-Y antigens in the absence of functional radiosensitive host hematopoietic-derived antigen-presenting cells. Blood. 119 (16), 3844-3853 (2012).
- Luzina, I. G., et al. Spontaneous formation of germinal centers in autoimmune mice. Journal of leukocyte biology. 70 (4), 578-584 (2001).
- Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 4 (1), a015529 (2014).
