Inductible, Expression spécifique au Type cellulaire chez Arabidopsis thaliana médiation par le biais de LhGR Trans-Activation

Une limitation majeure en biologie dans l’ère postgénomique est à déchiffrer le rôle spécifique du contexte d’un facteur donné ou perturbation génétique. Constitutives perturbations génétiques comme les approches de perte de fonction et de gain de fonction permettent souvent seulement point final une analyse des processus d’adaptation permanente, dissimuler la distinction entre les effets primaires et secondaires. En outre, des fonctions spécifiques de contexte peuvent être masquées ou diluées par des effets à grande échelle en tissus éloignés ou pendant d’autres phases de développement. En outre, dans les cas extrêmes, la létalité peut empêcher toute idée mécanistique. Idéalement, pour contourner ces problèmes, on pourrait analyser l’effet d’une perturbation génétique aiguë dans un contexte spécifique tel qu’un type de cellule spécifique d’une manière résolue dans le temps. Pour ce faire, des outils génétiques pour inductible, expression spécifique au type de cellule sont requis¹. Pour fournir une ressource pour l’évaluation rapide de la dynamique spatio-temporelle d’une réponse à un effecteur donné, nous avons combiné la facilité du clonage fournies par le système de GreenGate² avec l’efficacité prouvée du système GR-LhG4^{3, 4,5,6}. Nous avons généré un ensemble de lignes exprimant le facteur de transcription chimérique LhG4 fondu pour le domaine de liaison du ligand du récepteur (GR) corticoïdes rat⁷ sous le contrôle du type de cellule bien caractérisés promoteurs spécifiques⁸. En conditions de repos, le facteur de transcription reste en dehors du noyau, comme le domaine des ressources génétiques est lié par la HSP90 cytosolique. Avec l’ajout de ligands synthétiques dexaméthasone, translocation nucléaire est induite et LhG4 vont médier transcription des cassettes d’expression sous contrôle d’un promoteur analogues synthétiques de type pOp , comme un journaliste mTurquoise2 inclus dans les lignes correspondant au pilote de visualiser le domaine d’expression après l’induction.  Ainsi, les lignes correspondant au pilote techniquement aussi contenant une cassette d’effecteur. La traversée d’un ensemble de lignes correspondant au pilote avec une ligne transportant une cassette d’effecteur avec, par exemple, un gène d’intérêt sous le contrôle du même promoteur pOp-type donc permet une évaluation rapide des conséquences aiguës ou à long terme d’expression de l’effecteur dans un large éventail de types de cellules.

Ici, nous fournissons un protocole décrivant les procédures nécessaires pour générer les lignes pilote et effectrices et démontrer comment expression spécifiques du type cellulaire peut être induite et suivie dans le méristème apical, le méristème apical racinaire et le cambium de Arabidopsis. Pour illustrer la prouesse et la spécificité de cette approche, nous utilisons le facteur de transcription bien connu VND7 qui est capable de piloter des épaississements de mur de cellules du xylème secondaire façon ectopique⁹. Traitement de F1 d’un croisement entre la ligne de pilote pSCR^10,11 et l’effecteur pOp6:VND7 conduit à la formation des cellules du xylème ectopiques dans la gaine de l’amidon de l’ Arabidopsis , les cellules souches.

Pour faciliter la génération de grands assemblages d’ADN requis pour construire des plasmides d’expression conducteur et effectrices, nous avons utilisé le GreenGate rapide et efficace méthode²le clonage. GreenGate clonage est basé sur les enzymes de restriction type II S tels Eco31I ou ses isochizomère BsaI². Ces enzymes couper en aval de leurs sites de reconnaissance asymétrique produisant des surplombs avec des variables de composition en bases. En intégrant l’ éco31I /Bsaj’ai des sites de restriction en oligonucléotides et affectation des séquences spécifiques de porte-à-faux à des éléments d’ADN, clonage modulaire est atteint, facilitant la génération de grandes assemblées. Dans le cadre de GreenGate, modules d’ADN relèvent de catégories Qu’a à F repose sur la séquence de surplomb qui servent de cartes et sont montés dans cet ordre. Les amorces conçues pour amplifier votre produit désiré devraient donc selon le module sélectionné² (Figure 1 a). Si il y a un interne Eco31I /Bsaje site et la séquence n’est pas compatible avec les modules d’entrée et de la destination de GreenGate, vous pouvez procéder sans la mutagenèse, mais avec une efficacité moindre. Également utiliser mutagenèse pour supprimer Eco31I /Bsaj’ai des sites de restriction prenant soin de ne pas pour changer d’acides aminés dans les produits des gènes.