単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

生体分子の拡散的な挙動を調べることは、その生物学的機能に関する洞察を提供する。蛍光顕微鏡ベースの技術は、生体分子をネイティブの細胞環境で観察するための貴重なツールとなっています。光漂白後の蛍光回収(FRAP)および蛍光相関分光法(FCS)1は、アンサンブル平均拡散行動を提供する。逆に、単一分子局在化顕微鏡は、高い空間および時間分解^能2、3、4を有する個々の蛍光タグ付き分子の観察を可能にする。目的のタンパク質が異なる拡散状態に存在する可能性があるため、個々の分子を観察することは有利です。例えば、大腸菌のCueRのような転写レギュレータがサイトゾルで自由に拡散したり、DNA配列に結合したりすると、2つの容易に区別可能な拡散状態が生じ、測定5のタイムスケールで固定化^される5.単一分子トラッキングは、これらの異なる状態を直接観察するためのツールを提供し、それらを解決するために高度な分析は必要ありません。ただし、拡散率が類似している場合は、複数の拡散状態とその母集団の割合を解決することがより困難になります。例えば、拡散係数の大きさ依存性のために、タンパク質の異なるオリゴマー化状態は、異なる拡散状態6、7、8、9として現れる^,10.このような場合は、データの取得、処理、分析の面で統合されたアプローチが必要です。

サイトソリック分子の拡散率に影響を与える重要な因子は、細胞境界による閉じ込めの影響である。細菌細胞境界によって分子運動に対する制限により、細胞細胞分子の測定拡散速度は、同じ運動が閉じ込められていない空間で発生した場合よりも遅く見える。非常にゆっくりと拡散する分子の場合、細胞閉じ込めの効果は、境界との衝突の欠如のためにごくわずかです。このような場合、ブラウン運動の方程式に基づく解析モデルを使用して、分子変位、r、または明らかな拡散係数D*の分布を合わせることによって、拡散状態を正確に解決することができるかもしれません(ランダム拡散)^11,12,13.しかし、細胞細胞分子の拡散が速い場合、実験分布は、細胞境界との拡散分子の衝突による非限定ブラウン運動のために得られたものに似なくなりました。蛍光標識分子の非限定拡散係数を正確に決定するためには、閉じ込め効果を考慮する必要があります。いくつかのアプローチは、最近、(半)解析的^{に5、14、15、16、}またはモンテカルロシミュレーションを通じて、閉じ込め効果を説明するために開発されました。 ブラウン拡散 6^{,10,16,17,18,19}.

ここでは、単一分子追跡に特に焦点を当てた単一分子局在顕微鏡データを収集および分析するための統合プロトコルを提供する。このプロトコルの最終目標は、内部の蛍光標識細胞質タンパク質の拡散状態を解決する(この場合は、棒状の細菌細胞)。我々の研究は、単一分子追跡のための以前のプロトコルに基づいて構築され、DNAポリメラーゼPolIは、拡散^分析20によってDNA結合および非結合状態に存在することが示された。ここでは、単分子トラッキング解析を3D測定に拡張し、よりリアルな計算シミュレーションを実行して、細胞内に同時に存在する複数の拡散状態を解決・定量化します。このデータは、二重らせん点広がり関数(DHPSF)21,22を用いて撮像することにより蛍光発光器の3D位置を決定することができる自家製の3D超解像蛍光顕微鏡を用いて取得される。生の単一分子画像は、カスタム書き込みソフトウェアを使用して3D単分子ローカリゼーションを抽出して処理され、単一分子軌道に結合されます。何千もの軌道がプールされ、明らかな拡散係数の分布が生成されます。最後のステップでは、実験分布は、限られた体積でブラウン運動のモンテカルロシミュレーションを介して得られた数値生成分布に適合します。このプロトコルを適用して、生きているエルシニア・エンテロコリチカにおけるタイプ3分泌系タンパク質YscQの拡散状態を解決する。そのモジュラー性質のために、私達のプロトコルは、一般的に任意の細胞形状の単一分子または単一粒子追跡実験の任意のタイプに適用可能です。