Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

Examinar o comportamento difusivo de biomoléculas fornece a introspecção em suas funções biológicas. Técnicas baseadas em microscopia de fluorescência tornaram-se ferramentas valiosas para observar biomoléculas em seu ambiente de células nativas. A recuperação da fluorescência após o photobranqueamento (Frap) e a espectroscopia da correlação da fluorescência (FCS)¹ fornecem comportamentos difusivo Ensemble-calculados. Inversamente, a microscopia da localização da único-molécula permite a observação de moléculas cDNAs etiquetadas individuais com definição espacial e temporal elevada^2,3,4. Observar moléculas individuais é vantajoso desde que uma proteína do interesse pode existir em Estados difusivo diferentes. Por exemplo, dois Estados difusivo prontamente distinguíveis surgem quando um regulador transcricional, tal como o cubador em Escherichia coli, difunde livremente no citosol ou se liga a uma seqüência do ADN e se torna imobilizado no temporal da medida⁵ . Rastreamento de molécula única fornece uma ferramenta para observar esses diferentes Estados diretamente, e análises sofisticadas não são necessárias para resolvê-los. No entanto, torna-se mais desafiador resolver vários Estados diffusivos e suas frações populacionais nos casos em que suas taxas diffusivas são mais semelhantes. Por exemplo, devido à dependência de tamanho do coeficiente de difusão, diferentes Estados de oligomerização de uma proteína se manifestam como diferentes Estados diffusivos^{6,7,8,9 , 10}. esses casos exigem uma abordagem integrada em termos de aquisição, processamento e análise de dados.

Um fator crítico que influencia as taxas difusivo de moléculas citosólico é o efeito do confinamento pelo limite da pilha. As restrições colocadas no movimento molecular por um limite de células bacterianas causam uma taxa de difusão medida das moléculas citosómicas para parecer mais lenta do que se o mesmo movimento tivesse ocorrido em um espaço não confinado. Para moléculas muito lentamente difuso, o efeito do confinamento celular é insignificante devido à falta de colisões com o limite. Nesses casos, pode ser possível resolver com precisão os Estados diffusivos, ajustando as distribuições de deslocamentos moleculares, rou coeficientes de difusão aparente, D *, utilizando modelos analíticos baseados nas equações para o movimento browniano ( difusão aleatória)^11,12,13. No entanto, para a difusão rápida de moléculas citosómicas, as distribuições experimentais já não se assemelham àquelas obtidas para o movimento browniano não confinado devido a colisões de moléculas de difusão com os limites das células. Os efeitos de confinamento devem ser contabilizados para determinar com precisão os coeficientes de difusão não confinados das moléculas rotuladas fluorescentamente. Várias abordagens foram recentemente desenvolvidas para dar conta dos efeitos de confinamento (semi-) analiticamente ^5,14,15,16 ou numericamente através de simulações de Monte Carlo de Difusão Brownian^{6,10,16,17,18,19}.

Aqui, nós fornecemos um protocolo integrado para coletar e analisar dados da microscopia da localização da único-molécula com um foco particular no seguimento da único-molécula. O objetivo final do protocolo é resolver Estados diffusivos de proteínas citosómicas rotuladas fluorescentamente no interior, neste caso, células bacterianas em forma de haste. Nosso trabalho constrói em um protocolo precedente para o seguimento da único-molécula, em que um polymerase do ADN, PolI, foi mostrado para existir em um estado encadernado e não acoplado do ADN pela análise de difusão²⁰. Aqui, nós expandimos a análise de rastreamento de molécula única para medições 3D e executamos simulações computacionais mais realistas para resolver e quantificar vários Estados diffusivos simultaneamente presentes nas células. Os dados são adquiridos usando um microscópio de fluorescência 3D de super resolução, construído em casa, que é capaz de determinar a posição 3D dos emissores fluorescentes por imagem com a função de propagação de pontos de dupla hélice (dhpsf)^21,22. As imagens RAW de molécula única são processadas usando um software escrito personalizado para extrair as localizações de molécula única 3D, que são combinadas em trajetórias de moléculas únicas. Milhares de trajetórias são agrupadas para gerar distribuições de coeficientes de difusão aparente. Em uma etapa final, as distribuições experimentais são encaixadas com distribuições numericamente geradas obtidas através de simulações de Monte-Carlo de movimento browniano em um volume confinado. Nós aplicamos este protocolo para resolver os Estados difusivo do tipo-3 proteína yscq do sistema da secreção em viver Yersinia enterocolitica. Devido à sua natureza modular, nosso protocolo é geralmente aplicável a qualquer tipo de experimento de rastreamento de única molécula ou de partículas únicas em geometrias de células arbitrárias.