작은 인도 몽구스(헤르페스 오로 punctatus)에서이오페녹산 유사체의 분석은 구강 광견병 예방 접종 생물학적 마커로 사용하기위한 세라
Summary
우리는 에틸 또는 메틸 이오페노산과 함께 포로 몽구스 위약 경용 광견병 백신 미끼를 바이오마커로 제공하고 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 방법을 사용한 새로운 액체 크로마토그래피를 사용하여 미끼 섭취를 검증했습니다.
Abstract
작은 인도 몽구스(Herpestes auropunctatus)는푸에르토리코에서 광견병 바이러스 (RABV)의 저수지이며 매년보고되는 동물 광견병 사례의 70 % 이상을 포함합니다. 야생 동물 저수지에서 RABV 순환의 제어는 일반적으로 구강 광견병 예방 접종 (ORV)의 전략에 의해 수행됩니다. 현재 푸에르토리코에는 야생 동물 ORV 프로그램이 없습니다. 구강 광견병 백신 및 몽구스를 위한 각종 미끼 모형에 대한 연구는 유망한 결과로 실시되었습니다. ORV의 성공을 모니터링하는 것은 일반적으로 RABV 중화 항체 (RVNA) 포스트 예방 접종의 변화를 평가하는 것을 포함하는 표적 종에 의하여 미끼 섭취를 추정에 의존합니다. 이 전략은 활성 야생 동물 ORV 프로그램을 가진 지역 또는 RABV가 Enzootic 및 RVNA의 배경 수준이 저수지 종에 존재하는 지역에서 해석하기 어려울 수 있습니다. 이러한 상황에서, 백신 또는 미끼 매트릭스와 통합된 바이오마커가 유용할 수 있다. 우리는 미끼 내부0.4 %와 1 %의 농도에서 에틸 이오페노산 (et-IPA)을 함유 한 16 개의 포로 몽구스 위약 ORV 미끼를 외부 미끼 매트릭스에서 제공했습니다. 우리는 또한 외부 미끼 매트릭스에서 0.035 %, 0.07 %, 0.14 %의 농도로 메틸 – 이오페노산 (me-IPA)을 함유 한 12 개의 포로 몽구스 ORV 미끼를 제공했습니다. 우리는 미끼 제공 하기 전에 혈 청 샘플을 수집 하 고 최대 8 주 포스트 제공에 대 한 다음 매주. 우리는 혈청에서 아세토니트릴로 이오페노산산을 추출하고 액체 크로마토그래피/질량 분석법을 사용하여 정량화했습니다. 우리는 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 et-IPA 또는 me-IPA에 대한 세라를 분석했습니다. 우리는 et-me-IPA에 대해 적어도 8 주와 4 주 동안 적절한 마킹 능력을 발견했습니다. 두 IPA 유도체 모두 몽구스에서 ORV 미끼 섭취량의 현장 평가에 적합할 수 있다. 몽구스 세라에서 마커의 수명으로 인해 연속 평가 중에 동일한 IPA 유도체를 사용하여 결과를 혼동하지 않도록 주의해야 합니다.
Introduction
광견병 바이러스(RABV)는 부정적 감각의 단일 좌초 된 lyssavirus이며, 카니보라와 치옵테라 의 주문 내에서 다양한 야생 동물 저수지 종 들 사이에서 순환한다. 몽구스의 여러 종은 RABV의 저수지이며, 작은 인도 몽구스(Herpestes auropunctatus)는푸에르토리코와 서반구 1,2,3의 다른 카리브 해 제도에서 유일한 저수지입니다 . 야생 동물 저수지에서 RABV 순환의 제어는 일반적으로 구강 광견병 예방 접종 (ORV)의 전략을 통해 수행됩니다. 미국(미국)에서는 이 관리 활동이 USDA/APHIS/야생 동물 서비스 국립 광견병 관리프로그램(NRMP) 4에 의해 조정됩니다. 현재 푸에르토리코에는 야생 동물 ORV 프로그램이 없습니다. 광견병 백신및 몽구스를 위한 다양한 미끼 종류에 대한 연구는 몽구스를 위한 ORV 프로그램이가능하다는 것을 시사하는 유망한 결과로 실시되어 5,6,7,8.
ORV의 충격을 감시하는 것은 일반적으로 RV 항체 혈청증에 있는 변경을 평가하는 관련시키는 표적 종에 의하여 미끼 옥천을 추정에 의존합니다. 그러나, 이 전략은 활성 야생 동물 ORV 프로그램을 가진 지역 또는 RV가 RABV 중화 항체 (RVNA)의 enzootic 및 배경 수준이 저수지 종에서 존재하는 지역에서 도전적일 수 있습니다. 이러한 상황에서, 미끼 또는 외부 미끼 매트릭스에 포함된 바이오마커가 유용할 수 있다.
다양한 생물학적 마커는 너구리(프로시온 로터)9,10,stoats (무스텔라에르민)11,12,유럽 오소리 등 수많은 종에서 미끼 섭취를 모니터링하는 데 사용되어 왔다. 멜레스 멜레스) 13,멧돼지(수스 스크로파)14,작은 인도 몽구스15 및 대초원 개 (Cynomysludovicianus)16,17,다른 사람의 사이에서. 미국에서, 수술 ORV 미끼는 종종 미끼 매트릭스에서 1% 테트라사이클린 바이오마커를 포함하여 미끼 흡기18,19를모니터링한다. 그러나, 테트라사이클린의 사용에 대한 단점은 환경에 항생제의 분포에 대한 우려가 증가하고 테트라 사이클린의 검출이 일반적으로 침략적이라는 것을 포함, 뼈를 얻기 위해 동물의 치아 추출 또는 파괴를 요구 샘플20. 로다민 B는 다양한 조직에서 마커로 평가되어 왔으며 모발 및 수염10,21에서자외선(UV) 빛및 형광을 이용하여 검출될 수 있다.
이오페노산(IPA)은 코요테(Canis latrans)에서 미끼 소비를 평가하는 데사용되어 온백색, 결정성 분말로, 북극여우(Vulpeslagopus)23,붉은 여우(Vulpesvulpes)24,너구리 9개 , 25,멧돼지14,붉은 사슴 (세르부스elaphus scoticus)26,유럽 오소리12 및 페렛 (M.furo)27,다른 여러 포유류 종 중. IPA의 체류시간은 종에 따라 2주 미만의 28,29,26주 이상, 26주 이상 국내견(Canislupusfamiliaris)에서 52주 이상이다. 보존 시간은 또한 용량 의존적 일 수있다31. 이오페녹산은 혈청 알부민에 강하게 결합하고 역사적으로 혈중 요오드 수치32를측정하여 검출되었다. 이러한 간접접근법은 UV 검출33을통해 이오페노산 농도를 직접 측정하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법에 의해 대체되었고, 결국 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법(LCMS)으로 대체되었습니다. 34,35. 이 연구를 위해, 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 방법을 이용한 매우 민감하고 선택적인 액체 크로마토그래피가 개발되어 다중 반응 모니터링(MRM)을 활용하여 이오페노산의 두 가지 유사체를 정량화합니다. 우리의 목표는 2-(3-하이드록시-2,4,6-triiodobenzyl) 프로파노산(메틸-IPA 또는 me-IPA) 및 2-(3-하이드록시-2,4,6-트리오도벤실)부타노산(에틸-IPA 또는 IPA 에서 전달될 때)의 마킹 능력을 평가하기 위해 이 LC-MS/MS 방법을 사용하는 것이었습니다. 포로 몽구스에게 미끼를.
몽구스는 시판되는 훈제 소시지와 생선 기름으로 미끼를 찍은 케이지 트랩에서 라이브 포획되었습니다. 몽구스는 개별 60 cm x 60cm x 40cm 스테인레스 스틸 케이지에 보관하고 시판되는 닭 허벅지로 일주일에 두 번 보충된 상업용 건식 고양이 사료를 매일 50g씩 먹였습니다. 물은 사용할 수 있는 광고 libitum. 우리는 위약 ORV 미끼에 포로 몽구스에 IPA, 에틸-IPA와 메틸-IPA의 두 가지 유도체를 전달했다. 모든 미끼는 분말 닭 계란및 젤라틴(재료표)을 함유하는 외부 코팅(이하 “미끼 매트릭스”)을 가진 28 mmx 20 mm x 9 mm 호일 블리스터 팩으로 구성되었다. 미끼는 0.7 mL의 물 또는 IPA 유도체를 포함하고 약 3 g의 무게를 가했으며, 그 중 ~2 g은 외부 미끼 매트릭스였다.
우리는 3 개의 농도에서 16 포로 몽구스 et-IPA를 제공: 0.14% (2.8 mg et-IPA ~ 2 g 미끼 매트릭스; 3 남성 [m], 3 여성 [f]), 0.4 % (0.7 mL 블리스터 팩 볼륨에서 2.8 mg et-IPA, 3m, 3f), 및 1.0 % (0.7 mL 블리스터 팩 볼륨에서 7.0 mg 에틸-IPA; 2m , 2f). 의 전반적인 복용량 2.8 mg의 복용량 속도에 해당 5 mg/kg27,36 푸에르토리코에서 560 g의 평균 몽구스 무게에 따라. 우리는 연구가 일부 바이오 마커에 대한 맛 혐오가 일부 종37에서 농도 >1%에서 발생할 수 있음을 시사하는 가장 높은 농도로 1 %를 선택했습니다. 우리는 블리스터 팩에서 1% 용량만 제공했는데, 응집은 용매에서 용해되는 용질이 미끼 매트릭스에 균등하게 통합될 만큼 충분히 용해되는 것을 방지하였다. 1개의 대조군 (2m, 1f)은 멸균수와 IPA가 없는 미끼를 받았다. 우리는 아침 (~8 시)에 매일 유지 보수 배급을 먹이기 전에 몽구스에게 미끼를 제공했습니다. 미끼는 약 24시간 후에 제거되었다. 우리는 치료 전에 혈액 샘플을 수집, 하루 후 치료 후 다음 매주 최대 8 주 후 치료. 우리는 이소플루란 가스를 흡입하여 몽구스를 마취시키고 페렛38에대해 설명된 바와 같이 두개골 정맥의 정맥에 의해 전혈의 1.0 mL까지 수집했다. 우리는 전혈 샘플을 원심 분리하고, 혈청을 극저온으로 옮기고 분석할 때까지 -80°C에서 저장했습니다. 모든 동물은 동물의 건강에 반복 혈액 무승부의 영향을 최소화하기 위해 모든 기간 동안 샘플링되지 않았습니다. 대조군 동물을 0일째에 샘플링한 다음, 매주 최대 8주 동안 치료 후 샘플링하였다.
우리는 3 개의 농도에서 me-IPA를 전달: 0.035% (0.7 mg), 0.07% (1.4 mg) 그리고 0.14% (2.8 mg), 모든 미끼 매트릭스에 통합, 와 함께 2 남성과 2 치료 그룹 당 여성. 두 남성과 두 여성은 멸균 물과 IPA로 가득 미끼를 받았다. 미끼 제공 시간과 몽구스 마취는 위에서 설명합니다. 우리는 1 일째에 치료 전에 혈액 샘플을 수집한 다음 매주 최대 4 주까지 치료 후.
우리는 정상성에 대한 혈청 농도 데이터를 테스트하고 다른 치료 그룹의 혈청 IPA 농도에 대한 추정 수단. 우리는 선형 혼합 모델을 사용하여 개인에 걸쳐 풀린 평균 혈청 et-IPA 농도를 비교했습니다. 미끼 유형(매트릭스/블리스터 팩)은 실험일 이외에 고정된 효과가었으며, 동물 ID는 무작위 효과였습니다. 모든 프로시저는 공통 통계소프트웨어(자료표)를사용하여 실행되었고 유의성은 α =0.05로 평가하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
연구를 위해 개발된 LC-MS/MS 방법은 몽구스 혈청에서 me-IPA 및 et-IPA를 정확하게 정량화하기 위해 다중 반응 모니터링의 선택성을 활용하였다. MS/MS 검출의 선택성은 또한 분석 전에 혈청에서 단백질을 침전시키기 위하여 아세토니트릴에 전적으로 의존하는 간단한 정리 프로토콜을 허용했습니다.
이오페노산은 ACN에서 용해되지만 물에 실질적으로 용해되지 않습니다. ACN 추출로?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 농무부, 동물 및 식물 건강 검사 서비스, 야생 동물 서비스, 국립 광견병 관리 프로그램 및 IDT 바이오로지카(독일 데사우-로슬라우)의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Acetonitrile, Optima grade | Fisher | A996 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size | Waters Corp. | 186003085 | |
| ESI Source | Agilent | G1958-65138 | |
| Ethyl-iophenoxic acid, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lot MKBP5399V |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher | A117 | |
| LCMS software | Agilent | MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis | |
| Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR0709514717 |
| Microanalytical balance | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Oral Rabies Vaccine Baits | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany | N/A | |
| Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR100612108RR |
| Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
| Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined | Agilent | 5190-7024 | |
| Sodium chloride, Certified ACS grade | Fisher | S271 | |
| Statistical Software Package | SAS Institute, Cary, North Carolina, USA | N/A | |
| Trifluoroacetic acid, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Vortex Mixer | Glas-Col | 099A PV6 | |
| 0.2-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.413 | |
| 0.5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.421 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-µL capacity pipette tips | GeneMate | P-1233-1250 | |
| 1-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.43 | |
| 2-mL amber screw-top autosampler vials | Agilent | 5182-0716 | |
| 5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.456 | |
| 80-position microcentrifuge tube rack | Fisher | 05-541-2 | |
| 8-mL amber vials with PTFE-lined caps | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) isopropanol | Fisher | A459 | |
| 100-1000 µL air displacement pipette | Eppendorf | ES-100 |
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