تحليل نظائرها حمض الأيوفينوكسيك في النمس الهندي الصغير (الهربساتوبوتوس)سيرا لاستخدامها كعلامة بيولوجية التطعيم داء الكلب عن طريق الفم
Summary
قدمنا النمس الأسير لقاح داء الكلب عن طريق الفم الطعوم مع حمض الإيثيل أو ميثيل iophenoxic كعلامة حيوية والتحقق من تناول الطعم باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة الجديدة مع قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (LC-MS /MS) طريقة.
Abstract
النمس الهندي الصغير (الهربسأوروبوتوس)هو خزان من فيروس داء الكلب (RABV) في بورتوريكو، ويضم أكثر من 70٪ من حالات داء الكلب الحيوانيالمبلغ عنها سنويا. وعادة ما يتم التحكم في دوران رابف في خزانات الحياة البرية من خلال استراتيجية للتطعيم عن طريق الفم ضد داء الكلب (ORV). ولا يوجد حاليا ً أي برنامج لـ ORV للحياة البرية في بورتوريكو. وقد أجريت بحوث في لقاحات داء الكلب الفموي وأنواع الطعم المختلفة للنمس بنتائج واعدة. يعتمد رصد نجاح ORV على تقدير تناول الطعم من قبل الأنواع المستهدفة، والذي ينطوي عادة على تقييم تغيير في RABV تحييد الأجسام المضادة (RVNA) بعد التطعيم. وقد يكون من الصعب تفسير هذه الاستراتيجية في المناطق التي يوجد فيها برنامج نشط للأحياء البرية أو في المناطق التي يكون فيها هذا البرنامج غير صحيح، وتوجد مستويات خلفية من RVNA في أنواع المكامن. وفي مثل هذه الحالات، قد يكون من المفيد وضع علامة بيولوجية مدمجة مع اللقاح أو مصفوفة الطعم. قدمنا 16 النمس الأسير الطعوم الغفل ORV التي تحتوي على حمض إيثيل iophenoxic (et-IPA) في تركيزات من 0.4٪ و 1٪ داخل الطعم و 0.14٪ في مصفوفة الطعم الخارجي. كما قدمنا 12 النمس الأسير ORV الطعوم التي تحتوي على حمض ميثيل iophenoxic (me-IPA) في تركيزات 0.035٪، 0.07٪ و 0.14٪ في مصفوفة الطعم الخارجي. جمعنا عينة مصل قبل تقديم الطعم ومن ثم أسبوعيا لمدة تصل إلى ثمانية أسابيع بعد العرض. لقد استخرجنا أحماض الأيوفينوكسيوك من سيرا إلى أسيتاتونيتريل وكمي باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة/قياس الطيف الكتلي. قمنا بتحليل سيرا لET-IPA أو me-IPA عن طريق قياس الطيف الكتلي اللوني السائل. وجدنا قدرة كافية على وضع العلامات لمدة ثمانية وأربعة أسابيع على الأقل لـ ET-and me-IPA، على التوالي. ويمكن أن يكون كل من مشتقات وكالة تشجيع الاستثمار مناسبة للتقييم الميداني لطعم ORV في النمس. نظرا لطول العمر من علامة في النمس سيرا، يجب الحرص على عدم الخلط بين النتائج باستخدام نفس مشتق IPA خلال التقييمات المتتالية.
Introduction
فيروس داء الكلب (RABV) هو شعور سلبي واحد الذين تقطعت بهم السبل ليسافيروس، ويدور بين الأنواع المتنوعة من خزانات الحياة البرية داخل أوامر Carnivora وChiroptera. أنواع متعددة من النمس هي خزانات RABV، والنمس الهندي الصغير (الهربسauropunctatus)هو الخزان الوحيدفي بورتوريكو والجزر الكاريبية الأخرى في نصف الكرة الغربي 1،2،3 . وعادة ما يتم التحكم في دوران رابف في خزانات الحياة البرية من خلال استراتيجية للتطعيم عن طريق الفم ضد داء الكلب (ORV). في الولايات المتحدة (الولايات المتحدة)، يتم تنسيق هذا النشاط الإداري من قبل وزارة الزراعة الأمريكية / APHIS / خدمات الحياة البرية الوطنية إدارة البرنامج (NRMP)4. ولا يوجد حاليا ً أي برنامج لـ ORV للحياة البرية في بورتوريكو. وقد أجريت البحوث في لقاحات داء الكلب وأنواع الطعم المختلفة للنمس مع نتائج واعدة تشير إلى برنامج ORV للنمس ممكن5،6،7،8.
يعتمد رصد تأثير ORV على تقدير تناول الطعم من قبل الأنواع المستهدفة، والذي ينطوي عادة على تقييم تغيير في الانتشار المصلي للجسم المضاد للفيروسات القهقرية. ومع ذلك، قد تكون هذه الاستراتيجية صعبة في المناطق التي توجد فيها برامج نشطة للفيروسات القهقرية أو في المناطق التي تكون فيها RV هي الإنزوتيك ومستويات خلفية من الأجسام المضادة لتحييد RABV (RVNA) موجودة في أنواع المكامن. وفي مثل هذه الحالات، قد يكون من المفيد وضع علامة بيولوجية مدرجة في الطعم أو مصفوفة الطعم الخارجي.
وقد استخدمت علامات بيولوجية مختلفة لرصد تناول الطعم في العديد من الأنواع، بما في ذلك الراكون(Procyon lotor)9،10، stoats (Mustelaermine)11،12، الشارات الأوروبية ( ميليس ميليس) 13، الخنازير البرية (سوس سكروفيه)14، النمس الهندي الصغير15 والكلاب البراري (Cynomysludovicianus)16،17، من بين أمور أخرى. في الولايات المتحدة، غالبا ما تشمل الطعوم ORV التشغيلية 1٪ التتراسيكلين biomarker في مصفوفة الطعم لرصد الطعم التناول18،19. ومع ذلك، فإن العيوب في استخدام التتراسيكلين تشمل القلق المتزايد بشأن توزيع المضادات الحيوية في البيئة، وأن الكشف عن التتراسيكلين هو عادة الغازية، مما يتطلب استخراج الأسنان أو تدمير الحيوان للحصول على العظام عينات20. وقد تم تقييم Rhodamine B كعلامة في مجموعة متنوعة من الأنسجة ويمكن الكشف عنها باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) الضوء والفلورة في الشعر وشعيرات10،21.
حمض الايوفينوكسيك (IPA) هو مسحوق أبيض بلوري تم استخدامه لتقييم استهلاك الطعم في القيوط(كانيس لاترانس)22، ثعلب القطب الشمالي (فولبيسلاغوبوس)23، الثعلب الأحمر (الفرج الفرج)24، الراكون 9 , 25، الخنزير البري14، الغزلان الحمراء(سيرفوس elaphus scoticus)26، الشارات الأوروبية12 وferrets (M.furo)27، من بين العديد من الأنواع الثدييات الأخرى. أوقات الاحتفاظ من IPA يختلف حسب الأنواع من أقل من أسبوعين في بعض marsupials28،29، إلى ما لا يقل عن 26 أسبوعا في ungulates26 وأكثر من 52 أسبوعا في الكلاب المنزلية (كانيس الذئبةfamiliaris)30. قد تكون أوقات الاحتفاظ أيضا تعتمد على الجرعة31. حمض Iophenoxic يربط بقوة إلى الزلال المصل واكتشفت تاريخيا عن طريق قياس مستويات اليود في الدم32. وحلت محل هذا النهج غير المباشر أساليب التصوير اللوني السائل عالية الأداء (HPLC) لقياس تركيزات حمض الفينوإكسيوك مباشرة مع الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية33،وفي نهاية المطاف مع الكروماتوغرافيا السائلة وقياس الطيف الكتلي (LCMS) 34و35 . ولهذه الدراسة، تم تطوير التصوير اللوني السائل شديد الحساسية والانتقائية مع طريقة قياس الطيف الكتلي جنباً إلى جنب (LC-MS/MS) التي تستخدم رصد التفاعل المتعدد (MRM) لتحديد نظائرها من حمض الأيوفينوك. كان هدفنا هو استخدام طريقة LC-MS/MS هذه لتقييم قدرة وضع العلامات على حمض البربانويك 2-(3-هيدروكسي-2,4,6-triiodobenzyl) (ميثيل-IPA أو me-IPA) و2-(3-هيدروكسي-2,4,6-ترييودوبنزل) حمض البوتانويك (إيثيل-IPA أو et-IPA) وعند تسليمها في ORV الطعم إلى النمس الأسير.
تم القبض على النمس الحية في الفخاخ قفص الطعم مع النقانق المدخنة المتاحة تجاريا وزيت السمك. تم إيواء النمس في أقفاص فردية 60 سم × 60 سم × 40 سم من الفولاذ المقاوم للصدأ وتغذية حصة يومية من حوالي 50 غرام من أغذية القطط الجافة التجارية، تستكمل مرتين في الأسبوع مع فخذ الدجاج المتاحة تجاريا. المياه كانت متاحة ad libitum. سلمنا اثنين من مشتقات IPA، إيثيل-IPA وميثيل-IPA، إلى النمس الأسير في الطعوم ORV الغفل. وكانت جميع الطعوم تتكون من 28 مم × 20 مم × 9 مم احباط حزمة نفطة مع طلاءخارجي (فيما يلي “مصفوفة الطعم”) التي تحتوي على مسحوق بيض الدجاج والجيلاتين (جدول المواد). تحتوي الطعوم على 0.7 مل من الماء أو مشتق IPA وتزن حوالي 3 غرام، منها حوالي 2 غرام كانت مصفوفة الطعم الخارجي.
عرضنا 16 النمس الأسير وIPA في ثلاثة تركيزات: 0.14٪ (2.8 ملغ وIPA في مصفوفة الطعم ~ 2 غرام؛ 3 الذكور [م] ، 3 الإناث [و])، 0.4٪ (2.8 ملغ ET IPA في 0.7 مل حجم حزمة نفطة؛ 3M، 3F)، و 1.0٪ (7.0 ملغ إيثيل IPA في 0.7 مل حجم حزمة نفطة؛ 2M ، 2و). الجرعة الإجمالية من 2.8 ملغ يتوافق مع معدل جرعة من 5 ملغ /كغ27,36 ويستند إلى متوسط وزن النمس من 560 غرام في بورتوريكو. اخترنا 1٪ كأعلى تركيز كما تشير البحوث النفور من الذوق لبعض المؤشرات الحيوية قد تحدث في تركيزات >1٪ في بعض الأنواع37. قدمنا فقط جرعة 1٪ في حزمة نفطة كما منع التفلطاب من ذوبان في المذيب بما فيه الكفاية ليتم دمجها بالتساوي في مصفوفة الطعم. تلقت مجموعة تحكم واحدة (2M، 1f) الطعوم مليئة بالماء المعقمة وليس IPA. عرضنا الطعوم على النمس في الصباح (حوالي 8 صباحا) أثناء أو قبل تغذية حصص الصيانة اليومية الخاصة بهم. وأُزيلت بقايا الطعم بعد حوالي 24 ساعة. جمعنا عينات الدم قبل العلاج، يوم واحد بعد العلاج ومن ثم أسبوعيا تصل إلى 8 أسابيع بعد العلاج. نحن النمس التخدير عن طريق استنشاق غاز isoflurane وجمعما ما يصل إلى 1.0 مل من الدم كله عن طريق الوريد من الوريد الجمجمة كافا كما هو موضح للنمس38. قمنا بالطرد المركزي لعينات الدم بأكملها، ونقلنا سيرا إلى الفيارير اتّساها في -80 درجة مئوية حتى التحليل. لم يتم أخذ عينات من جميع الحيوانات خلال جميع الفترات الزمنية لتقليل آثار الدم المتكرر على صحة الحيوانات. تم أخذ عينات من الحيوانات السيطرة في اليوم 0، ثم أسبوعيا لمدة تصل إلى 8 أسابيع بعد العلاج.
قدمنا لي-IPA في ثلاثة تركيزات: 0.035٪ (0.7 ملغ)، 0.07٪ (1.4 ملغ) و 0.14٪ (2.8 ملغ)، وكلها أدرجت في مصفوفة الطعم، مع 2 الذكور و 2 الإناث لكل مجموعة العلاج. تلقى ذكران وامرأتان طعوم مليئة بالماء المعقم وليس وكالة تشجيع الاستثمار. يتم وصف الطعم الذي يقدم الأوقات وتخدير النمس أعلاه. جمعنا عينات الدم قبل العلاج في اليوم الأول، ثم الأسبوعية لمدة تصل إلى 4 أسابيع بعد العلاج.
اختبرنا بيانات تركيز المصل للطبيعية والوسائل المقدرة لتركيزات IPA المصل من مجموعات العلاج المختلفة. استخدمنا نموذج ًا خطيًا مختلطًا لمقارنة تركيزات المصل وIPA المتوسطة المجمعة عبر الأفراد. نوع الطعم (مصفوفة / حزمة نفطة) كان تأثير ثابت بالإضافة إلى اليوم التجريبي، في حين أن هوية الحيوان كان تأثير عشوائي. تم تشغيل جميع الإجراءات باستخدامالبرمجيات الإحصائية المشتركة (جدول المواد) وتم تقييم الأهمية في α = 0.05.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت طريقة LC-MS/MS التي تم تطويرها للدراسات انتقائية رصد ردود الفعل المتعددة لتحديد كمية البيانات والإبأعلى نحو دقيق في مصل النمس. كما سمحت الانتقائية للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد/MS لبروتوكول تنظيف بسيط يعتمد فقط على الأسيتاتونيتريل لتعجيل البروتينات من المصل قبل التحليل.
<p …Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج البحوث داخل الجدارية من وزارة الزراعة الأمريكية، ودائرة التفتيش على صحة الحيوان والنبات، وخدمات الحياة البرية، والبرنامج الوطني لإدارة داء الكلب وIDT Biologika (Dessau-Rosslau، ألمانيا).
Materials
| Acetonitrile, Optima grade | Fisher | A996 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size | Waters Corp. | 186003085 | |
| ESI Source | Agilent | G1958-65138 | |
| Ethyl-iophenoxic acid, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lot MKBP5399V |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher | A117 | |
| LCMS software | Agilent | MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis | |
| Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR0709514717 |
| Microanalytical balance | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Oral Rabies Vaccine Baits | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany | N/A | |
| Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR100612108RR |
| Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
| Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined | Agilent | 5190-7024 | |
| Sodium chloride, Certified ACS grade | Fisher | S271 | |
| Statistical Software Package | SAS Institute, Cary, North Carolina, USA | N/A | |
| Trifluoroacetic acid, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Vortex Mixer | Glas-Col | 099A PV6 | |
| 0.2-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.413 | |
| 0.5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.421 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-µL capacity pipette tips | GeneMate | P-1233-1250 | |
| 1-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.43 | |
| 2-mL amber screw-top autosampler vials | Agilent | 5182-0716 | |
| 5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.456 | |
| 80-position microcentrifuge tube rack | Fisher | 05-541-2 | |
| 8-mL amber vials with PTFE-lined caps | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) isopropanol | Fisher | A459 | |
| 100-1000 µL air displacement pipette | Eppendorf | ES-100 |
Riferimenti
- Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
- Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, West Indies, and implications for control. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (10), e3251 (2004).
- Monroe, B. P., et al. Rabies surveillance in the United States during 2014. Journal of the American Veterinary Medical Association. 248 (7), 777-788 (2015).
- Slate, D., et al. Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the United States. Virus Research. 111, 68-76 (2005).
- Blanton, J. D., et al. Vaccination of small Asian mongoose (Herpestes javanicus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 42 (3), 663-666 (2006).
- Vos, A., et al. Oral vaccination of captive small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 49 (4), 1033-1036 (2013).
- Berentsen, A. R., Johnson, S. R., VerCauteren, K. C. Evaluation of ONRAB® bait matrix flavor preference by mongoose (Herpestes auropunctatus) in Puerto Rico: Implications for Oral Rabies Vaccination. Caribbean Journal of Science. 48 (1), 52-58 (2014).
- Ortmann, S., et al. Safety studies with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in the small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus). BMC Veterinary Research. 14 (1), 90 (2018).
- Linhart, S. B., et al. A field evaluation of baits for delivering oral rabies vaccines to raccoons (Procyon lotor). Journal of Wildlife Diseases. 30 (2), 185-194 (1994).
- Fry, T. L., Atwood, T., Dunbar, M. R. Evaluation of rhodamine B as a biomarker for raccoons. Human Wildlife Interactions. 4 (2), 275-280 (2010).
- Jones, C., Moller, H., Hamilton, W. A review of potential techniques for identifying individual stoats (Mustela erminea) visiting control or monitoring stations. New Zealand Journal of Zoology. 31 (3), 193-203 (2004).
- de Leeuw, A. N. S., Smith, G. C., Woods, J. A. Use of iophenoxic acid to assess bait uptake by European badgers. Advances in Vertebrate Pest Management. 4, 243-254 (2006).
- Southey, A. K., Sleeman, D. P., Gormley, E. Sulfadimethoxine and rhodamine B as oral biomarkers for European badgers (Meles meles). Journal of Wildlife Diseases. 38 (2), 378-384 (2002).
- Massei, G., Jones, A., Platt, T., Cowan, D. P. Iophenoxic Acid as a Long-Term Marker for Wild Boar. Journal of Wildlife Management. 73 (3), 458-461 (2009).
- Creekmore, T. E., et al. Field evaluation of baits and baiting strategies for delivering oral vaccine to mongooses in Antigua, West Indies. Journal of Wildlife Diseases. 30 (4), 497-505 (1994).
- Creekmore, T. E., Rock, R. E., Hurley, J. A baiting system for delivery of an oral plague vaccine to black-tailed prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 38 (1), 32-39 (2002).
- Fernandez, J. R. R., Rocke, R. E. Use of Rhodamine B as a biomarker for oral plague vaccination of prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 47 (3), 765-768 (2011).
- Johnston, J. J., et al. Evaluation and significance of tetracycline stability in rabies vaccine baits. Journal of Wildlife Diseases. 41 (3), 549-558 (2005).
- Algeo, T. P., et al. Oral rabies vaccination variation in tetracycline biomarking among Ohio Raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 49 (2), 332-337 (2013).
- Crier, J. K. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 34 (4), 829-834 (1970).
- Fisher, P. Review of using Rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
- Knowlton, F. K., Savarie, P. J., Wahlgren, C. E., Hayes, D. J., Shumake, S. A., Bullard, R. W. Physiological marks by coyotes ingesting baits containing iophenoxic acid, Mirex and Rhodamine B. Vertebrate Pest Control and Management Materials. , 141-147 (1987).
- Follmann, E. H., Savarie, P. J., Ritter, D. G., Baer, G. M. Plasma marking of arctic foxes with iophenoxic acid. Journal of Wildlife Diseases. 23 (4), 709-712 (1987).
- Saunders, G., Harris, S., Eason, C. T. Iophenoxic acid as a quantitative bait marker for foxes. Wildlife Research. 20, 297-302 (1993).
- Hadidian, J., et al. Acceptance of simulated oral rabies vaccine baits by urban raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 25 (1), 1-9 (1989).
- Sweetapple, P. J., Nugent, G. Iophenoxic acid as a serum marker for red deer (Cervus elaphus scoticus). Wildlife Research. 25, 649-654 (1998).
- Ogilvie, S. C., Eason, C. T. Evaluation of iophenoxic acid and rhodamine B for marking feral ferrets (Mustela furo). New Zealand Journal of Zoology. 25 (2), 105-108 (1998).
- Eason, C. T., Batcheler, D., Frampton, C. M. Comparative pharmacokinetics of iophenoxic acid in cats and brushtail possums. Wildlife Research. 21, 377-380 (1994).
- Fisher, P. M., Marks, C. A. Evaluation of iophenoxic acid as a biomarker for swamp wallabies (Wallabia bicolor). Wildlife Research. 24, 97-103 (1997).
- Baer, G. M., Shaddock, J. H., Hayes, D. J., Savarie, P. Iophenoxic acid as a serum marker in carnivores. Journal of Wildlife Management. 49 (1), 49-51 (1985).
- Spurr, E. B. Iophenoxic acid as a systemic blood marker for assessment of bait acceptance by stoats (Mustela ermine) and weasels (Mustela nivalis). New Zealand Journal of Zoology. 29 (2), 135-142 (2002).
- Mudge, G. H., Strewler, G. J., Desbiens, N., Berndt, W. O., Wade, D. N. Excretion and distribution of iophenoxic acid. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 178 (1), 159-172 (1971).
- Jones, A. High-performance liquid chromatographic determination of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 654 (2), 293-296 (1994).
- Wiles, M. C., Campbell, T. A. Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for direct identification and quantification of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B. 832 (1), 144-157 (2006).
- Ballesteros, C., et al. Analysis by LC/ESI-MS of iophenoxic acid derivatives and evaluation as markers of oral baits to deliver pharmaceuticals to wildlife. Journal of Chromatography B. 878 (22), 1997-2002 (2010).
- Purdey, D. C., Petcu, M., King, C. M. A simplified protocol for detecting two systemic bait markers (Rhodamine B and iophenoxic acid) in small mammals. New Zealand Journal of Zoology. 30 (3), 175-184 (2003).
- Tobin, M. E., Koehler, A. E., Sugihara, R. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 60 (1), 202-207 (1996).
- Briscoe, J. A., Syring, R. Techniques for emergency airway and vascular access in special species. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 13 (3), 118-131 (2004).
- Eason, C. T., Frampton, C. M. The plasma pharmacokinetics of iophenoxic and iopanoic acids in goat. Xenobiotica. 2 (2), 185-189 (1992).
- Hilton, H. E., Dunn, A. M. S. . Mongooses: their natural history. , (1967).
- Stevens, C. E., Hume, I. D. . Comparative physiology of the vertebrate digestive system. Second edition. , (1995).
- National Rabies Management Program (NRMP). . Oral rabies vaccination draft operations manual. , (2009).
