Usando Caenorhabditis elegans para estudar trans-e multi-Generational efeitos de toxicants
Summary
Os efeitos trans e multigeracionais dos produtos químicos persistentes são essenciais para julgar as suas consequências a longo prazo no ambiente e na saúde humana. Nós fornecemos métodos detalhados novos para estudar efeitos trans e multi-Generational usando elegans da Caenorhabditisdo nematóide da livre-vida.
Abstract
Informações sobre toxicidades de produtos químicos são essenciais na sua aplicação e gestão de resíduos. Para os produtos químicos em baixas concentrações, os efeitos a longo prazo são muito importantes para julgar as suas consequências no ambiente e na saúde humana. Ao demonstrar influências de longo prazo, os efeitos dos produtos químicos ao longo das gerações em estudos recentes fornecem novas percepções. Aqui, nós descrevemos protocolos para estudar efeitos dos produtos químicos sobre gerações múltiplas usando elegans da Caenorhabditisdo nematóide da livre-vida. Dois aspectos são apresentados: (1) estudos de efeito trans-geracional (TG) e (2) multigeracional, sendo este último separado para estudos de exposição multigeracional (MGE) e de efeito multigeracional residual (MGR). O estudo do efeito TG é robusto com um objetivo simples de determinar se a exposição química aos pais pode resultar em quaisquer consequências residuais na descendência. Após os efeitos são medidos sobre os pais, soluções de hipoclorito de sódio são usados para matar os pais e manter a prole de modo a facilitar a medição de efeito sobre a prole. O estudo do efeito TG é usado para determinar se a prole é afetada quando seu pai é exposto aos poluentes. O estudo do efeito MGE e MGR é sistematical usado para determinar se a exposição geracional contínua pode resultar em respostas adaptativas na prole ao longo das gerações. O pick-up e a transferência cuidadosos são usados para distinguir gerações para facilitar a medida do efeito em cada geração. Nós igualmente combinamos protocolos para medir mudanças do comportamento da locomoção, da reprodução, do tempo, as bioquímicas e da expressão genética. Alguns exemplos de experimentos também são apresentados para ilustrar os estudos de efeito trans e multigeracional.
Introduction
A aplicação e gestão de resíduos de produtos químicos é altamente dependente da informação dos seus efeitos em determinadas concentrações. Notavelmente, o tempo é outro elemento essencial entre efeitos e concentrações. Ou seja, produtos químicos, especialmente aqueles em baixas concentrações nos ambientes reais, precisam de tempo para provocar efeitos mensuráveis1. Portanto, os pesquisadores organizam diferentes comprimentos da duração da exposição em experimentos com animais, e até mesmo cobrem todo o ciclo de vida. Por exemplo, camundongos foram expostos à nicotina por 30, 90 ou 180 dias para estudar seus efeitos tóxicos 2. No entanto, tais durações de exposição ainda não são suficientes para elucidar os efeitos a longo prazo dos poluentes (por exemplo, poluentes orgânicos persistentes [POPs]) que podem durar mais de gerações de organismos no ambiente. Portanto, estudos sobre os efeitos sobre as gerações estão ganhando mais e mais atenção.
Existem dois aspectos principais nos estudos de efeito geracional. O primeiro é o estudo de efeito trans-geracional (TG) que pode testar de forma robusta se a exposição química aos pais pode resultar em quaisquer consequências na descendência3. O segundo é um estudo de efeito multigeracional que é mais sistemático com considerações tanto na exposição quanto nos efeitos residuais. Por um lado, os efeitos da exposição multigeracional (MGE) são usados para ilustrar as respostas adaptativas nos animais aos ambientes desafiadores de longo prazo. Por outro lado, os efeitos residuais multigeracionais (MGR) são utilizados para demonstrar as consequências residuais a longo prazo após a exposição, uma vez que a exposição materna é acompanhada com exposição embrionária à primeira prole e exposição da linha germinal à segunda descendência que torna a terceira descendência como a primeira geração completamente fora da exposição4.
Embora os mamíferos (por exemplo, camundongos) sejam organismos modelo em estudos de toxicidade, especialmente em relação aos seres humanos, sua aplicação no estudo de efeitos geracionais é bastante demorada, cara e eticamente a respeito de 5. Assim, os organismos, incluindo o crustásio Daphnia magna6, o inseto Drosophila melanogaster7 e o zebrafish Danio rerio8, proporcionam opções alternativas. No entanto, esses organismos ou falta de semelhanças com os seres humanos, ou necessitam de equipamentos específicos em estudos.
A Caenorhabditis elegans é um pequeno nematódeo de vida livre (aproximadamente 1 mm de comprimento) com um ciclo de duração curto (aproximadamente 84 h a 20 ° c)9. Este nematódeo compartilha muitas vias biológicas conservadoras para os seres humanos, e, portanto, tem sido amplamente empregado para ilustrar os efeitos de várias tensões ou tóxicos10. Notavelmente, 99,5% dos nematoides são hermafroditas, tornando esses organismos extremamente adequados para o estudo de efeitos geracionais, por exemplo, efeitos de TG de metais pesados e sulfonamidas3,11, efeitos de MGE de nanopartículas de ouro e pesados metais12 e temperatura13, Mgr efeitos da sulfonamida14, e ambos os efeitos MGE e Mgr da irradiação gama15 e lindano4. Além disso, foram encontrados resultados comparáveis entre os efeitos dos produtos químicos (por exemplo, zearalenona) no desenvolvimento e reprodução de camundongos e C. elegans16,17, o que proporcionaria uma vantagem para extrapolar efeitos deste pequeno animal para os seres humanos.
Ambos os estudos de efeito TG e MG são demorados e precisam de um design cuidadoso e desempenho. Notavelmente, existiam diferenças nas escolhas de estágio de vida, condições de exposição e métodos de separação de gerações nos estudos supracitados. Tais diferenças dificultaram a comparação direta entre os resultados e dificultaram a interpretação dos resultados. Portanto, é imperativo estabelecer protocolos uniformes para orientar os estudos de efeitos de TG e MG, e também para fornecer um quadro maior para revelar padrões semelhantes de vários tóxicos ou poluentes em conseqüências a longo prazo. O objetivo mais longo dos protocolos atuais demonstrará processos claros de operação no estudo de efeitos trans e multigeracionais com C. elegans. Os protocolos beneficiarão os pesquisadores que estão interessados em estudar os efeitos a longo prazo de tóxicos ou poluentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A fim conduzir com sucesso o protocolo descrito, as seguintes sugestões devem ser levadas em consideração. Realize as operações experimentais gerais em um ambiente estéril. A operação inadequada pode resultar na contaminação das cepas de e. coli , por exemplo, fungos e ácaros podem dificultar o crescimento normal de C. elegans e, portanto, afetam os resultados experimentais. Na seção que descreve cultivar c. elegans, Observe a escala de crescimento de c. elegans sobre o ng…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
Riferimenti
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