Tomografía de coherencia óptica 3D automatizada para dilucidar la morfogénesis de Biofilm a grandes escalas espaciales
Summary
Las biopelículas microbianas forman arquitecturas complejas en las interfases y se convierten en patrones espaciales altamente dependientes de la escala. Aquí, presentamos un sistema experimental (duro y software) para la adquisición automatizada de conjuntos de datos de tomografía de coherencia óptica 3D (OCT). Este conjunto de herramientas permite la caracterización no invasiva y multiescala de la morfogénesis de biopelículas en el espacio y el tiempo.
Abstract
Las biopelículas son un estilo de vida microbiano más exitoso y prevalecen en una multitud de entornos ambientales y de ingeniería. Comprender la morfogénesis del biofilm, es decir, la diversificación estructural de las biopelículas durante el ensamblaje comunitario, representa un desafío notable a través de escalas espaciales y temporales. Aquí, presentamos un sistema automatizado de imágenes de biopelículas basado en la tomografía de coherencia óptica (OCT). OCT es una técnica de imagen emergente en la investigación de biopelículas. Sin embargo, la cantidad de datos que actualmente se pueden adquirir y procesar obstaculiza la inferencia estadística de patrones a gran escala en la morfología del biofilm. El sistema automatizado de imágenes OCT permite cubrir grandes escalas temporales espaciales y extendidas del crecimiento de biopelículas. Combina un sistema OCT disponible comercialmente con una plataforma de posicionamiento robótico y un conjunto de soluciones de software para controlar el posicionamiento de la sonda de escaneo OCT, así como la adquisición y procesamiento de conjuntos de datos de imágenes de biopelícula 3D. Esta configuración permite el monitoreo automatizado in situ y no invasivo del desarrollo de biopelículas y puede desarrollarse para combinar imágenes OCT con macrofotografía y perfilado de microsensores.
Introduction
Las biopelículas son una adaptación de estilo de vida microbiana de gran éxito y estas comunidades de microorganismos asociadas a la interfase y en matriz dominan la vida microbiana en entornos naturales e industriales1,2. Allí, las biopelículas forman arquitecturas complejas, tales como serpentinas alargadas3, ondulaciones4 o tapas similares a setas5 con importantes consecuencias para el crecimiento de biopelículas, estabilidad estructural y resistencia al estrés6. Si bien se ha aprendido mucho sobre la diferenciación estructural de biopelículas a partir del trabajo en cultivosmonoespecie cultivados en cámaras de flujo en miniatura, la mayoría de las biopelículas son comunidades muy complejas que a menudo incluyen miembros de todos los dominios de la vida 6. Apreciar estas complejas biopelículas como paisajes microbianos7 y entender cómo interactúan la estructura y la función del biofilm en comunidades complejas está, por lo tanto, a la vanguardia de la investigación de biopelículas.
Una comprensión mecanicista de la morfogénesis de biopelículas complejas en respuesta a señales ambientales requiere experimentos cuidadosamente diseñados junto con observaciones resueltas espacial y temporalmente de la estructura física del biofilm a través de las escalas8. Sin embargo, la observación no destructiva del crecimiento de biopelículas en sistemas experimentales se ha visto severamente limitada por limitaciones logísticas como la necesidad de mover muestras (por ejemplo, a un microscopio) que a menudo dañan la delicada estructura del biofilm.
El protocolo presentado aquí introduce un sistema totalmente automatizado basado en la tomografía de coherencia óptica (OCT), que permite la monitorización in situ y no invasiva de la morfogénesis de biopelículas a la mesoescala (rango mm). OCT es una técnica de imagen emergente en la investigación de biopelículas con aplicaciones en el tratamiento del agua y la investigación de biofouling, medicina9 y ecología de corriente10. En LOS PTU, una fuente de luz de baja coherencia se divide en una muestra y un brazo de referencia; se analiza la interferencia de la luz reflejada y dispersa por el biofilm (brazo de muestra) y la luz del brazo de referencia. Se adquiere una serie de perfiles de intensidad axial (A-scans) que contienen información estructural resuelta en profundidad y se fusionan en un B-scan (una sección transversal). Una serie de escaneos B adyacentes compone el escaneo de volumen 3D final10. OCT proporciona una resolución óptica lateral en el rango de aproximadamente 10 m y, por lo tanto, es muy adecuado para estudiar la diferenciación estructural mesoscópica de biopelículas10,12. Para una descripción más detallada de LOS PTU, consulte Drexler y Fujimoto13y Fercher y sus colegas14. Aunque el campo de visión de un único xy-scan OCT alcanza hasta cientos de micrómetros cuadrados, los patrones de mayor escala no se pueden cuantificar mediante PTU en un solo escaneo. Con respecto a las biopelículas en hábitats naturales como arroyos y ríos, esto limita actualmente nuestra capacidad de evaluar la morfogénesis de biopelículas a escalas que coincidan con la plantilla física e hidráulica del hábitat.
Para superar estos límites espaciales y adquirir exploraciones DE OCT automáticamente, se montó una sonda de imágenes OCT de dominio espectral en un sistema de posicionamiento de 3 ejes. La instalación permite la adquisición de varios escaneos OCT en un patrón de mosaico superpuesto (escaneode teselas), logrando efectivamente la imagen tomográfica de áreas superficiales de hasta 100 cm 2. Además, la alta precisión de posicionamiento de este sistema permite monitorear de forma fiable el crecimiento y desarrollo de características de biopelículas en sitios específicos durante experimentos a largo plazo. El sistema es modular e individual (es decir, dispositivo de posicionamiento y OCT) de la instalación se puede utilizar como soluciones independientes o combinarse de forma flexible. La Figura 1 proporciona una visión general de los componentes de hardware y software de la instalación.
El sistema fue probado con un dispositivo de posicionamiento CNC controlado por GRBL disponible comercialmente (Tablade materiales). Las distancias de funcionamiento de esta plataforma de posicionamiento específica son de 600 x 840 x 140 mm, con una precisión indicada por el fabricante de +/- 0,05 mm y una resolución programable de 0,005 mm. GRBL es un código abierto (licencia GPLv3), control de movimiento de alto rendimiento para CNC Dispositivos. Por lo tanto, cada dispositivo de posicionamiento basado en GRBL (versión > 1.1) debe ser compatible con las directrices y paquetes de software que se presentan aquí. Además, el software podría adaptarse a otros controladores stepmotor con tipo de entrada STEP-DIR con pocas modificaciones.
El dispositivo OCT utilizado para evaluar el rendimiento del sistema (Tablade materiales)cuenta con una fuente de luz de baja coherencia con una longitud de onda central de 930 nm (ancho de banda de 160 nm) y longitud e intensidad ajustables del brazo de referencia. En el ejemplo presentado aquí, también se utilizó un adaptador de inmersión para sumergir la sonda OCT en agua corriente (Tabla de materiales). El paquete de software desarrollado aquí para la adquisición automatizada de escaneo OCT depende críticamente del SDK proporcionado junto con el sistema OCT específico, sin embargo, los sistemas OCT del mismo fabricante con diferentes lentes de escaneo y longitudes de onda centrales deben ser fácilmente compatible.
El dispositivo GRBL está controlado por un servidor web instalado en un equipo de una sola placa (Figura1). Esto otorga control remoto del dispositivo desde cualquier ordenador con acceso a internet o red local. El dispositivo OCT es controlado por un ordenador independiente, lo que permite el funcionamiento del sistema OCT aparte de la configuración experimental automatizada. Por último, los paquetes de software incluyen bibliotecas para sincronizar el posicionamiento de la sonda OCT y la adquisición de análisis de OCT (es decir, para adquirir automáticamente datasets de imágenes 3D en un patrón de mosaico o en un conjunto de posicionesdefinidas). Definir la posición de la sonda OCT en 3D permite ajustar eficazmente el plano focal específicamente para conjuntos (regionales) de escaneos. Específicamente, en superficies desiguales, se pueden especificar diferentes planos focales (es decir, diferentes posiciones en dirección z) para cada escaneo OCT.
Se desarrolló un conjunto de paquetes de software para procesar escaneos de OCT sin procesar (Tabla 1). La navegación del dispositivo de posicionamiento, la adquisición de escaneo OCT y el procesamiento de conjuntos de datos se realizan con cuadernos Jupyter codificados por Python, lo que permite una flexibilidad notable en el desarrollo y optimización del software. Dos ejemplos trabajados y anotados de dichos cuadernos (para la adquisición y el procesamiento de imágenes, respectivamente) están disponibles en https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git están diseñados como puntos de partida para la personalización del método. Un bloc de notas de Jupyter es una aplicación basada en navegador web que contiene celdas con código Python anotado. Cada paso está contenido en una celda del bloc de notas, que se puede ejecutar por separado. Debido a la diferente longitud de la trayectoria de la luz a través de la lente de exploración (aberración esférica)15, los escaneos de Oct crudos aparecen distorsionados (Figura2A). Hemos desarrollado un algoritmo para corregir automáticamente esta distorsión en los escaneos DE OCT adquiridos (contenido en ImageProcessing.ipynb, Archivo Suplementario 1). Además, la morfología de la biopelícula se puede visualizar como un mapa de elevación 2D, como se utilizó anteriormente en los sistemas de membrana16,e ilustramos cómo se pueden coser los mapas de elevación obtenidos de escaneos tomados en una matriz de mosaicos.
Por último, la funcionalidad de la instalación de laboratorio descrita se ilustra mediante un experimento de flume en el que el biofilm de flujo fototrófico está expuesto a un gradiente de velocidad de flujo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las imágenes OCT son adecuadas para resolver estructuras en el rango de micrómetros con un FOV de varios milímetros cuadrados. Por lo tanto, es una poderosa herramienta para la investigación de biopelículas10,18. Sin embargo, OCT se limita actualmente a un área de escaneo máxima de 100 – 256 mm2, mientras que los patrones estructurales de biopelícula a menudo superan esta escala espacial19, especialmente cuando la difere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mauricio Aguirre Morales por su contribución al desarrollo de este sistema. El apoyo financiero vino de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia a T.J.B.
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
Riferimenti
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