Tägliche Phototherapie mit rotem Licht zu regulieren Candida Albicans Biofilm Wachstum
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bewertung der Ergebnisse der Rotlicht-Anwendung auf das Wachstum von Candida Albicans Biofilm. Eine nicht-kohärente Rotlicht-Gerät mit der Wellenlänge von 635 nm und Energiedichte von 87,6 J·cm-2 wurde in das Wachstum von Candida Albicans Biofilmen für 48 h angewandt.
Abstract
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Ergebnisse der Verpflegungspauschale Rotlicht Behandlung auf das Wachstum von Candida Albicans Biofilm zu beurteilen. Zur Steigerung der planktonischen Wachstums von C. Albicans SN425 wuchs der Befallsdruck auf Hefe Stickstoff Base Medien. Für Biofilmbildung waren RPMI 1640 Medien, die hohe Konzentrationen von Aminosäuren haben, angewandt, um Biofilm Wachstum zu helfen. Biofilmen von 48 h wurden zweimal täglich über einen Zeitraum von 1 min mit einem nicht-kohärente Licht Gerät behandelt (Rotlicht; Wellenlänge = 635 nm; Energiedichte = 87,6 J·cm-2). Als Positivkontrolle (PC), 0,12 % Chlorhexidin (CHX) angewendet wurde, und als Negativkontrolle (NC), 0,89 % NaCl auf die Biofilme angewendet wurde. Koloniebildenden Einheiten (KBE), trocken-Gewicht, löslichen und unlöslichen Exopolysaccharide wurden nach Behandlungen quantifiziert. Kurz, das Protokoll hier vorgestellte einfache, reproduzierbare und bietet Antworten zur Lebensfähigkeit, trocken-Gewicht und extrazelluläre Polysaccharid Beträge nach der Rotlicht-Behandlung.
Introduction
Die erhöhte Inzidenz von Diabetes, immunsuppressive Therapieanwendungen, HIV-Infektion, AIDS-Epidemie, invasive klinische Verfahren und Ausgedehntspektrum Antibiotika-Verbrauch in den letzten Jahren haben die Inzidenz von Candida Albicans erhöht im Zusammenhang mit Krankheiten1,2. C. Albicans -Infektionen sind häufig im Zusammenhang mit Biofilm Entwicklung und klinische Manifestationen, z. B. Candidose oder systemischen Manifestationen, z. B. geschwächtes1,2verursachen. Eines der bemerkenswertesten Virulenzfaktoren von Biofilm Wachstum ist die extrazelluläre Polysaccharid-Matrix-Einrichtung. Biofilmbildung arbeitet, um den Widerstand gegen bestehende Antimykotika, Umweltbelastungen und Wirt Abwehrmechanismen3zu erhöhen.
Der Biofilm-Wachstum von C. Albicans beginnt mit der frühen Einhaltung von planktonischen Zellen auf einem Substrat, gefolgt von der Vermehrung der Hefezellen durch die Substratoberfläche und Bodenaggregaten Wachstum. Die letzte Phase der Biofilm Wachstum ist die Reifungsphase, wobei hefeartigen Entwicklung wird unterdrückt, die Bodenaggregaten Entwicklung erweitert und die extrazelluläre Matrix umschließt den Biofilm-4. C. Albicans Exopolysaccharide (EPS) in der Matrix interagieren, um die Mannan-Glucan Komplex5,6bilden. Das Zusammenspiel von Exopolysaccharide ist von entscheidender Bedeutung für die Verteidigung von Biofilmen gegen Drogen-7. Daher konnte die Verringerung der EPS von C. Albicans extrazellulären Matrix die Entwicklung neuer Antibiofilm Protokolle für orale Candidiasis Steuerung unterstützen.
Licht reguliert das Wachstum, die Entwicklung und das Verhalten der verschiedenen Organismen8 und es wurde als eine antimikrobielle photodynamische antimikrobielle Chemotherapie (“Pakt”) angewandt. Pakt gilt ein sichtbares Licht einer bestimmten Wellenlänge und eine Licht-absorbierenden Photosensitizer9. Die Photosensibilisatoren haben jedoch Schwierigkeiten bei der Durchdringung des Biofilms verursacht geringere Wirksamkeit10. Das Scheitern von Therapeutika, Biofilme vollständig zu infiltrieren ist ein Grund, dass Biofilme gelegentlich traditionelle antimikrobielle Therapie3,5widerstehen. Um den geschlossenen mikrobiellen Zellen zu deaktivieren, müssen Antibiotika durch die extrazelluläre Matrix zu durchdringen; Dennoch charakterisiert die EPS ein Diffusionsprozess Hindernis für solche Moleküle durch Eingebung dem Grad ihrer Beförderung in den Biofilm oder durch Einflussnahme auf die Reaktion der antimikrobiellen mit der Matrix selbst11.
In Anbetracht der Nachteile des PAKTES erweist sich der Einsatz von Licht selbst als eine wertvolle Verbesserung. Vorläufige Daten ergab, dass die Behandlung mit Blaulicht zweimal täglich deutlich die Produktion von EPS-unlöslich in Streptococcus Mutans Biofilm gehemmt. Durch den Rückgang des EPS-unlösliche reduziertes Blaulicht Biofilm Wachstum. Die Ergebnisse der Phototherapie mit Rotlicht in C. Albicans Biofilme sind jedoch rar. Daher war das Ziel dieser Untersuchung, in welcher Weise Phototherapie mit rotem Licht das Wachstum und die Anordnung von C. Albicans Biofilm beeinflusst zu bewerten. Für die Behandlung zweimal täglich angepasst wir unser Labor vorherigen Protokolle9,12 um eine einfache und reproduzierbare Biofilm-Modell zur Verfügung zu stellen, die Antworten zur Lebensfähigkeit, liefert trocken-Gewicht und extrazelluläre Polysaccharide Beträge nach der Rotlicht-Behandlung. Das gleiche Protokoll kann andere Therapien zu Testzwecken verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Kultivierung von C. Albicans Biofilm sind: 1) zu tun, das Pre-Inokulum und das Inokulum YNB Medium ergänzt mit 100 mM Glucose; (2) auf die Adhäsion Phase 90 min warten und sorgfältig waschen zweimal die Brunnen mit 0,89 % NaCl, entfernen von Zellen nicht eingehalten; und 3) eingehalten Zellen Biofilmbildung, starten, da RPMI Hyphen Wachstum anregen wird RPMI Medium hinzufügen. Aneuploidien können auftreten, wenn C. AlbicansKultivierung. Infolgedessen …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. Malvin N. Janal und Dr. Iriana Zanin für die Entwicklung dieser Studie. Wir anerkennen auch Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) für die Spende von der Sorte, die in dieser Studie analysiert.
Materials
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
Riferimenti
- Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
- Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
- Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Overcoming antifungal resistance. Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
- Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
- Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
- Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).
- Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
- de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).
- Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).
- Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).
- Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
- Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
- Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
- Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).
