マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法
Summary
インビトロマイクロ核アッセイは、ゲノ毒性および細胞毒性を評価するための確立された方法ですが、手動顕微鏡検査を使用してアッセイを採点することは面倒であり、主観性とスコアラー間の変動に苦しんでいます。本論文では、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてアッセイの完全自動化バージョンを実行するために開発されたプロトコルについて述べた。
Abstract
インビトロ微小核(MN)アッセイは、細胞毒性およびゲノキシビリティを評価するためにしばしば使用されますが、手動顕微鏡検査を介してアッセイを採点することは面倒であり、スコアラー間の変動による結果の不確実性を引き起します。これを改善するために、自動スライドスキャン顕微鏡と従来のフローサイトメトリー法が導入され、スコアラーバイアスを除去し、スループットを向上させようとしています。しかし、これらの方法には、細胞の細胞質を可視化できない、フローサイトメトリーによる視覚的なMN検証や画像データストレージの欠如など、独自の固有の制限があります。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー(MIFC)は、これらの制限を克服する可能性を秘めています。MIFCは、顕微鏡検査の高解像度蛍光画像と、従来のフローサイトメトリーの統計的堅牢性と速度を組み合わせたものです。さらに、収集されたすべての画像は、線量固有のファイルに格納することができます。本論文では、MIFC上で完全に自動化されたMNアッセイを実行するために開発されたプロトコルについて述べた。ヒトリンパ芽球体TK6細胞は、低対性溶液(75mM KCl)を用いて拡大し、4%ホルマリンで固定し、核含有量をHoechst 33342で染色した。すべてのサンプルはMIFC上で懸濁液中で実行され、アッセイに必要なすべての主要事象の高解像度画像の取得を可能にした(例えば、MNの有無にかかわらず二重化細胞、および単核化細胞および多核化細胞)。画像はMIFCデータ解析ソフトウェアで自動的に識別、分類、列挙され、細胞毒性と無毒性の両方の自動スコアリングが可能でした。結果は、MIFCを使用してインビトロMNアッセイを行うことを示し、TK6細胞の曝露後の溶媒対照と比較した場合、MN周波数の統計的に有意な増加をいくつかの異なるレベルで検出することを可能にするミトマイシンCおよびコルチシンは、マンニトールへの曝露後にMN周波数の有意な増加が観察されない。
Introduction
インビトロマイクロ核(MN)アッセイは、化学的および医薬品開発、ならびに様々な暴露者の間でヒトバイオモニタリングなどの研究のいくつかの分野におけるスクリーニングツールとして細胞毒性および登録毒性を評価するために一般的に使用される試験である。環境、職業またはライフスタイルの要因1、2、3.MNは、2つの主要な娘核の1つに組み込まれない細胞分裂中に生成された染色体断片または全染色体からなる。テロ相に続いて、この染色体材料は、主核2のいずれかから分離された細胞質内の個々の丸みを帯びた体に形成される。したがって、MNはDNA損傷の代表であり、ゲノム毒性試験4のエンドポイントとして長年使用されてきた。MNを測定する最も適切な方法は、サイトカインシスブロック微小核(CBMN)アッセイである。CBMNアッセイを用いて、ビヌクレス細胞(BNC)におけるMNの周波数は、試料にサイトチャラシンB(Cyt-B)を組み込むことによって得点することができる。Cyt-Bは核分裂を可能にするが、細胞分裂を防ぎ、MNのスコアリングを5回しか分割していないBNCに制限する。
顕微鏡検査とフローサイトメトリーの両方を使用するプロトコルが開発され、検証され、インビトロMNアッセイ6、7、8、9、10を実行するために日常的に使用されています。11,12,13,14.顕微鏡検査は、MNが正当であることを視覚的に確認できることから利益を得るが、時間がかかり、スコアラー15間の変動が起こりやすい。これに対処するために、自動顕微鏡検査法は、スライドをスキャンし、核とMN 16、17、18、19の画像をキャプチャするために開発されましたが、細胞質を視覚化することはできません。MN が実際に特定のセルに関連付けられているかどうかを判断するのは困難です。さらに、これらの方法は、Cyt-B9を用いた場合の細胞傷害性の計算に必要な多核化(POLY)細胞(三角および四分円細胞を含む)を同定することが困難である。MNアッセイを行うために開発されたフローサイトメトリー法は、蛍光と前方および側散乱強度を用いて、lysis20,21に続いて細胞から解放された核とMNの両方の集団を同定する。 、22.これにより、数分で数千セルからデータを取得することができ、自動分析23を可能にします。しかし、細胞を視覚化できないと、スコア付けされたイベントが本物であることを確認できなくなります。さらに、細胞膜を溶解すると、Cyt-Bの使用を阻害するだけでなく、染色体凝集体やアポトーシス体などの他の破片を含む懸濁液を作成し、これらをMN24と区別する方法はありません。
これらの制限に照らして、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー(MIFC)は、顕微鏡検査の高解像度蛍光画像と従来のフローサイトメトリーの統計的堅牢性と速度を組み合わせたMNアッセイを実行するのに理想的なシステムです。MIFCでは、すべての細胞が流体系に導入され、流動細胞キュベットの中心に動的に集動されます。すべての細胞の直交照明は、明視野(BF)発光ダイオード(LED)、サイド散乱レーザーおよび(少なくとも)1つの蛍光レーザーの使用を使用することによって達成される。蛍光光子は、3つの(20x、40xまたは60x)高い数値開口対物レンズのいずれかによって捕捉され、スペクトル分解要素を通過します。フォトンは、電荷結合デバイス (CCD) カメラに焦点を当てて、フロー セルを通過するすべてのセルの高解像度画像を取得します。ぼかしやストリークを避けるために、CCDは、流れのセルの速度と同期して行から行下にピクセルコンテンツを転送することにより、オブジェクトを追跡する時間遅延統合(TDI)モードで動作します。ピクセル情報は、ピクセルの最後の行から収集されます。スペクトル分解と組み合わせたTDIイメージングにより、フローセルを通過するすべての細胞から最大12枚の画像(2BF、10蛍光)を同時に捕捉できます。キャプチャされたすべての画像はサンプル固有のデータファイルに保存されるため、MIFCデータ解析ソフトウェアを使用していつでも分析を実行できます。最後に、データファイルは、すべての二変量プロット上のセルラー画像とドット間のリンクを保持します。これは、従来の二変量プロット上の任意のドットを強調表示することができ、対応するBFおよび蛍光画像が25に表示されることを意味します。
近年、MIFCベースの方法は、トリアージ放射線バイオドシメトリー26、27、28、29、30、31および遺伝的両方のMNアッセイを行うために開発された。毒物学32、33テスト。本研究は、主核、MNおよび細胞質の細胞画像が他の方法26よりも高いスループットで画像化できることを実証した。MONOセル、NNC(MNの有無にかかわらず)、POLYセルを含む解析に必要なすべての細胞タイプは、MIFCデータ解析ソフトウェアで自動的に識別することができ、Fenechらによって開発されたスコアリング基準の実装は、によって達成されます。様々な数学的アルゴリズム6、34の使用。バイオドシメトリーの結果は、BNC29あたりのMNの速度を定量化する際に文献の他の自動化された方法から得られたものと用量応答較正曲線が大きさで類似していることを示した。さらに、毒物学の最近の研究は、MONO細胞、BNC(MNの有無にかかわらず)およびPOLY細胞の画像がMIFCを使用して自動的に捕捉、同定、分類、列挙できることを実証しました。プロトコルおよびデータ分析は、TK6細胞をいくつかのクラストゲンおよびアヌゲン32に暴露した後、細胞毒性および無毒性の計算を可能にした。
本論文で提示されるプロトコルは、MIFCを用いてインビトロMNアッセイを行う方法について説明する。この作業で使用されるサンプル処理技術は、単一のサンプルを処理するのに2時間未満で、他の方法と比較して比較的簡単に実行できます。MIFC 解析ソフトウェアのデータ分析は複雑ですが、このホワイト ペーパーで説明した手順に従って、分析テンプレートの作成は数時間で完了できます。さらに、テンプレートが作成されると、それ以上の作業を行わずに、収集されたすべてのデータに自動的に適用できます。このプロトコルは、TK6細胞をクラストゲンおよびアニューゲンに暴露するために必要なすべてのステップを概説し、細胞を培養、処理、染色する方法を説明し、MIFCを用いて高解像度画像を取得する方法を示す。さらに、本論文では、細胞毒性と無毒性の両方を計算する目的でMONO細胞、BNC、およびPOLY細胞を自動的に同定し、スコア付けするためにMIFCソフトウェアのデータを分析するための現在のベストプラクティスを示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
最近の出版物でVermaらは、フローサイトメトリーのハイスループットの利点と画像解析35のデータおよび画像記憶の利点を組み合わせたシステムを開発することの重要性を強調した。このホワイト ペーパーに記載されている IMFC in vitro MN アッセイは、この引用を満たしており、顕微鏡検査およびフローサイトメトリー法における前述の課題の多くを克服する可能性を秘めています。ここで説明するプロトコルは、細胞毒性と無毒性の両方がMIFCを用いて評価できることを示している。サンプル調製、細胞染色、データ収集は簡単ですが、プロトコルには常に実装する必要がある重要な手順がいくつかあります。細胞への塩化カリウム(KCl)の添加は、細胞を膨らみ、主核間の分離を生成するために重要である。これにより、マスキング アルゴリズムは、列挙に必要な BNC および POLY セル (POLY セル) 内のすべての個々の核を識別できます。さらに、KCLは正確なMNマスキングおよび定量のために不可欠である核とMNの間の分離を提供する。さらに、KClの添加に続くホルマリンの使用は、遠心分離中に細胞がlysingすることを防ぎます。サイトチャラシンBの添加により、複数の核分裂を受けたTK6細胞が非常に大きくなります。その結果、細胞質が壊れやすくなり、KClを添加した直後に遠心分離が行われれば、凍結が起こり得る。さらに、最終的な濃度ではなく、サンプル中の細胞数に応じてサンプルにHoechstを導入することは非常に重要です。例えば、Hoechstの最終的な濃度が10 μg/mLの最終濃度は、1 x 106細胞のサンプルを均一に染色しますが、5 x 106細胞を含むサンプルを適切に染色すされず、薄暗い核を有する多くの細胞が生じる可能性があり、分析が困難になります。また、MIFCに488nmおよび/または642nm励起レーザーが装備されている場合、MIFCが405 nm励起レーザーまたはDRAQ5を装備している場合、HoechstはDAPIなどの別のDNA色素に置き換えることができることに注意することも重要です。核汚れを修正する場合は、必要な/所望のレーザーパワーに適した濃度を見つけるために染色を力付けることが重要です。
MIFC でデータを収集する場合は、グラデーション RMS フィーチャに最適な領域境界を決定することが重要です。このプロトコルで提示される境界は、MIFC計測器間のわずかな変動のために調整が必要な場合があります。データ収集中にこの機能を適用することは、高度に集中した画像を確実にキャプチャするために不可欠です。データ ファイルにぼやけた画像や焦点が合っていない画像が多数含まれている場合、解析ソフトウェアのマスキング アルゴリズムがぼやけた領域の染色アーティファクトを誤ってハイライト表示し、多数の誤検知アーティファクトが MN としてスコア付けされる可能性があります。ここで説明する画像処理技術は難しいかもしれませんが、MIFCソフトウェアで解析テンプレートを開発すると、バッチ処理によりデータファイルを自動的に分析できるため、ユーザーの介入が不要になり、スコアラーバイアス。また、TK6細胞以外の細胞株を用いてアッセイを行う場合、細胞の形態特性(例えば、サイズ)がTK6細胞のものと異なるようにマスクおよび領域境界を修正する必要がある。
ここで提示された結果(図5)は、TK6細胞をミトマイシンCおよびコルチシンの様々な用量に暴露する際のMN誘導の統計的に有意な増加を示す。溶媒対照と比較した場合のMNの頻度の統計的に有意な増加は、両方の化学物質で複数の用量について観察された。さらに、マンニトールの用量は30%以上の細胞毒性を誘発せず、また、期待どおりに溶媒対照と比較した場合のMNの頻度の統計的に有意な増加も起用しなかった。この論文で説明するプロトコルは、MIFCを用いてインビトロMNアッセイを行い、陽性および陰性制御化学物質の両方から期待される結果を与える。MNの周波数とサイトカインシスブロック増殖指数(CBPI)の両方のベースライン値を開発するために、溶媒制御と陰性制御化学物質の両方を使用して多くの実験を行うことが非常に重要です。遺伝子毒性については、MN周波数の統計的に有意な増加は、使用される細胞タイプによく知られている必要があるベースラインMN周波数との比較によって決定される。さらに、すべての細胞毒性計算は、コントロールサンプルのCBPIに基づいているため、MONO、BNCおよびPOLY細胞のベースラインレートは、コントロールで十分に定量化されなければなりません。
MNアッセイの文脈でMIFCを使用することのいくつかの制限と利点は、前の研究29、32で説明されている。主な制限事項は、顕微鏡検査と比較した場合のMN周波数の低下に関するもので、分析ソフトウェアでスコアリング基準を実装する際の柔軟性の欠如とMIFCの被写界深度の限られた深さの両方から生じ込まれる可能性があります。十分に輪郭を描かれたマスクは、主核を正確に識別するために作成できますが、主核に触れている(または非常に近い)MNはBNCマスク内で捕捉される可能性があります。さらに、顕微鏡検査を使用してかなり簡単に採点できる非常に小さなMNは、小さなアーティファクトのスコアリングを避けるために、MNマスクの面積パラメータの下限のためにMIFCを使用する場合、おそらく誤って見逃されます。画像ベースのデータ解析の難しさに加え、その設計により、MIFCは3次元細胞物体の2次元投影画像を取得します。これにより、一部の MN は、2 つのメイン MN とは異なる深さでキャプチャされ、マスキングを使用して非常に暗く、コーザブルに見える可能性があります。さらに、MN のごく一部が 2 つの主要な核の 1 つの後ろに存在し、視覚化とスコア付けが不可能になります。したがって、これらの困難を考慮すると、低用量でMN周波数の有意な増加を解釈する際には注意が必要である。
これらの欠点にもかかわらず、ここで説明するMIFC法は、他の技術に対していくつかの利点を提供する。Fenechらは、MNアッセイ36の自動化されたシステムと方法論を開発する際に考慮すべき基準とガイドラインを提案した。これらには、主核および細胞質の直接可視化、試験対象の化学物質または薬剤の様々な用量からのMNの頻度の決定、形態を定量し、すべての位置を決定する能力が含まれるが、これらに限定されない。核とMNは、それらが細胞質内にあることを確認します。本論文は、インビトロMNアッセイを行うために開発されたMIFC法が、これらの基準を満たす(または満たす可能性を有する)ことを示す。具体的には、核とMNの画像は蛍光レーザーで捕捉することができ、細胞質画像はBF LEDを用いて得ることができる。正常な核形態を持つ細胞の画像は、高度なマスクと特徴の組み合わせを使用して、不規則な形態を持つ細胞から自動的に区別することができます。コルチシンおよびミトマイシンC(図5)に提示された結果は、溶媒対照と比較した場合、ジェノ毒性と細胞毒性の両方が様々な用量で評価され、統計的に有意なMN周波数がどこで観察されることを示しています。期待。さらに、OECD試験ガイドライン487は、細胞毒性を決定するために、テスト濃度当たり少なくとも500細胞と共に、MNの存在を評価するために、テスト濃度当たり2,000 BNCを採点することを推奨しています。これは手動顕微鏡検査を使用して1時間以上かかる場合があります。この論文のプロトコルと結果は、約6,000 BNC、16,000 MONO細胞、および800個のPOLY細胞を約20分で試験濃度当たりに捕捉し、スコア付けしたことを示している。このような短時間で得得たデータ取得の急速な速度と多数の候補細胞は、インビトロMNアッセイを実行するためにMIFCを採用するもう一つの重要な利点を強調しています。
本論文で発表された結果は励みになりますが、初期の概念実証法を代表しています。この研究は、カークランドら37で示唆されたような、複数のクラスと毒性および細胞毒性のメカニズムをカバーするより大きく、より多様な化学セットのより徹底的な調査によって続かれるべきである37しかし、時間と労働集約的であり、この論文の範囲外であるこの大規模な研究は、弱い毒性物質を確実に同定する方法の能力に関する貴重な洞察を提供する。ここで提示される方法論は、より大きな線量範囲にわたってより迅速かつ効率的なスクリーニングを可能にするマイクロウェル形式にまだ小型化されていない。したがって、現在の形では、ここで提示されるMIFCベースのインビトロMNアッセイは、労働集約的なフォローアップ研究や良好な実験室の実践に関する研究に最も適している可能性があります。しかし、この方法は引き続き最適化され、検証され、細胞の割合を増加させるアヌーゲン暴露など、形態に関連する化学的特異的事象を検出する柔軟性を高める可能性を秘めています。まだコーラブルである非円形核38.最後に、MIFC法は、MN誘導のメカニズムのより包括的なビューを提供するために、MNアッセイ(例えばキネトコレ染色)に追加のバイオマーカーを導入する機会を提供する。
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、以前の形式のデータ分析テンプレートの開発に取り組んだクリスティン・プロブスト(ルミネックス社)と、ヘイリー・パグスリー博士(ルミネックス株式会社)とフィル・モリッシー博士(ルミネックス株式会社)に感謝しています。原稿。
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 um filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | EMD Millipore | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | EMD Millipore | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
| MIFC analysis software – IDEAS | EMD Millipore | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | EMD Millipore | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100X | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1X | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | EMD Millipore | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| System Calibration Reagent – SpeedBead | EMD Millipore | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
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