In tempo reale Live-cella flusso Cytometry per indagare l'afflusso del calcio, la formazione del poro e fagocitosi dai recettori P2X7 in cellule progenitrici neurali adulto

Animali sono stati trattati in conformità con il codice di pratica australiana per la cura e l’uso di animali per scopi scientifici e approvati per l’uso dal comitato di etica animale di Griffith University. 1. Neurosphere cultura di cellule progenitrici neurali SVZ adulta e ippocampo Nota: Il protocollo di dissezione qui presentato si basa sul lavoro di Walker e Kempermann e un protocollo dettagliato per la dissezione delle cellule progenitrici neurali da topi adulti è disponibile altrove14. Condizioni di coltura sono state modificate da Babu e colleghi15. Sono stati utilizzati topi C57BL/6 femminili adulti 8 – 12 settimane di età. In una cappa di sicurezza biologica, preparare il terreno di coltura (neurale medio basale) completato con supplemento di proliferazione delle cellule staminali neurali, glutamina 2mm, 20 ng/mL fattore crescita epidermico (EGF), fattore di crescita di 10 ng/mL base del fibroblasto (bFGF) e 2 µ g/mL eparina. Eutanasia due topi da inalazione di CO2 . In alternativa, anestetizzare i topi secondo le linee guida istituzionali e immediatamente li eutanasia di dislocazione cervicale. Spruzzare le loro teste con etanolo al 70% e decapitare loro. Trasferire ogni testa in una provetta sterile contenente soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con soluzione 1x penicillina/streptomicina (P/S). Eseguire dissezioni in cappa a flusso laminare sotto un microscopio di dissezione. Utilizzando le forbici pinze e dissezione, rimuovere tessuti e ossa per esporre il cervello e trasferirlo in un piatto sterile contenente HBSS con P/S. Posizionare il lato ventrale del cervello fino e utilizzare un bisturi per effettuare un’incisione della corona completa attraverso il chiasma ottico. Tenete fermo il cervello con il forcipe e utilizzare uno swift, pulito, movimento verso il basso. Evitare il taglio per ridurre al minimo la morte delle cellule e per aiutare a mantenere la struttura del tessuto.Nota: Se non tiene saldamente, il cervello può inclinare in avanti durante il taglio, compromettere il numero di cellule progenitrici ottenute dalla SVZ. Isolare il SVZ dalla metà rostrale del cervello. Individuare entrambi i ventricoli, separati da setto, con il corpo calloso formando un ponte bianco sopra di loro. Utilizzare pinze per rimuovere il setto che separa i due ventricoli e isolare le pareti laterali dei ventricoli laterali anteriori. Questo scopo, tagliando via sopra, sotto, ai lati e nella parte anteriore con le forbici dissezione bene. Ci rimane solo una piccola tazza-come forma. Preparare un coperchio piatto pulito di Petri con poche gocce di HBSS nel mezzo e trasferire la SVZ al liquido. Non lasciare il tessuto a secco o di toccare una superficie asciutta. Stare al lato mentre ippocampi di dissezione. Isolare gli ippocampi dalla metà caudale del cervello. Tagli una linea mediana tra gli emisferi di recidere il corpo calloso. Utilizzare i ventricoli laterali come guida e aprire delicatamente la corteccia per esporre l’ippocampo. Una volta srotolata la corteccia, l’ippocampo può essere visto come una struttura densa, bianca, curva. Utilizzare pinze o forbici per dissezione bene per isolare l’ippocampo dai tessuti vicini. Con una pinza, rimuovere l’eccesso della materia bianca, vasi sanguigni e qualsiasi tessuto membranoso che copre l’ippocampo. Preparare un coperchio piatto Petri pulito preparato con poche gocce di HBSS e trasferire l’ippocampo al liquido. Ripetere per l’altro emisfero. Una volta che l’ippocampo e la SVZ da due topi sono stati isolati e trasferito al loro rispettivo di Petri coperchi, dadi meccanicamente il tessuto usando un bisturi. Tagliare il tessuto in una capsula di Petri coperchio per circa 1 min, rotazione ogni 10 s fino a quando il tessuto appare liscio e solo raffinati pezzi rimangono. Prendere un bisturi pulito e ripetere per l’altro piatto, tagliare il tessuto per 1 min. Utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire tutto il tessuto da ogni coperchio piastra di Petri per separare le provette contenenti 1 mL di acido di 0,25% tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA). Utilizzare un tubo per il SVZ e un tubo per l’ippocampo. Fare questo primo pipettaggio circa la metà di tripsina-EDTA al tessuto nel piatto per ridurre al minimo le bolle d’aria e per evitare che il tessuto venga a contatto con la punta della pipetta asciutto come è trasferito al tubo. Risciacquare il piatto e la lama del bisturi con il resto della tripsina-EDTA per raccogliere quanto più tessuto possibile e aggiungerlo al tubo. Incubare il tessuto con la tripsina in bagnomaria a 37 ° C per 30 minuti, agitando il tubo ogni 10 min per dissociare correttamente il tessuto. Triturare il tessuto usando un vetro lucidati a fuoco pipetta Pasteur per creare una sospensione unicellulare. Fare attenzione a non overtriturate ciò causerebbe la lisi cellulare eccessiva. Questo è un passo fondamentale per dissociazione ottimale dei tessuti. Osservare il contenuto del tubo durante il processo di triturazione e interrompere al più presto segni che la maggior parte dei grumi di tessuto è stati rimossi. La soluzione di tripsina dovrebbe diventare leggermente nuvolosa quando le cellule sono andati in sospensione unicellulare, anche se alcuni grumi possono rimanere.Nota: Come indicazione, passando la sospensione su e giù per 10 x x-15 è adeguata. Terreno di coltura di aggiungere fino a 5 mL per neutralizzare la tripsina e girare a 300 x g per 3 min lavaggio un ulteriore 2x con HBSS e pass mezzo attraverso un colino di cella 70 µm per rimuovere qualsiasi tessuto ciuffi. Trasferire tutte le celle in 15 mL di terreno in un pallone di cultura cellulare T75.Nota: Sfere dovrebbero formare nel passaggio zero (P0) cultura SVZ dopo 7-10 giorni e dopo 15 – 20 giorni nella cultura hippocampal. Astenersi da lavare o nutrire le cellule durante questo tempo di massimizzare il numero di cellule progenitrici neurali nella cultura. Se più progenitori sono necessari, o per diminuire il tempo di incubazione di P0, è possibile aumentare il numero di topi sacrificati. Mantenere le colture a 37 ° C con 5% CO2 e, dopo la fase iniziale della cultura P0, passaggio ogni 7 – 10 giorni se necessario usando un pratiche di coltura del tessuto mobile e standard di sicurezza biologica.Nota: La cultura di hippocampal P0 deve generare abbastanza sfere per passaggio in un matraccio da T25; la cultura SVZ genererà molte altre sfere e possa essere attraversata in un T75. Se le sfere hippocampal P0 hanno aderito, è possibile utilizzare una pipetta 200 µ l per sollevare delicatamente la sfera. Passaggio le sfere quando raggiungono 150-200 µm di diametro. Raccogliere le sfere e le medie in una provetta da 15 mL e consentire le sfere per depositarsi per gravità per circa 5 min. in alternativa, far girare a bassa velocità (100 x g) per 2 min. Rimuovere il mezzo e dissociare le cellule con il reagente di dissociazione per 7 – 10 min, a seconda della dimensione delle sfere.Nota: Il reagente di dissociazione utilizzato avrà effetti significativi sul risultato della cultura, così si prega fare riferimento alla Tabella materiali per informazioni specifiche. Lavare le cellule aggiungendo 5 mL di HBSS per la soluzione di cella e centrifugare a 300 x g per 3 min. eliminare il surnatante, risospendere le cellule in terreno di coltura e di semi a circa 150.000 cellule in 5 mL di terreno in un matraccio di cultura cellulare T25 o equivalente. Mantenere le colture a 37 ° C e 5% CO2. Verificare lo stato di cellule progenitrici neurali identificando l’espressione di marcatori di cellule staminali come Sox2 e ASCL1 prima di procedere a qualsiasi protocollo a valle9.Nota: Questo può essere fatto dal metodo preferito del ricercatore (ad es., immunochimica di microscopia, citometria a flusso o macchia occidentale, o usando reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR)). 2. preparazione di una sospensione di singola cellula per l’analisi di citometria a flusso Preparare il supporto richiesto. Questi sono i seguenti. Preparare mezzo Na+ che contiene 145 mM NaCl, 5 mM KOH, 10 mM HEPES, 5mm D-glucosio, 0,1% albumina di siero bovino (BSA) e 0,1 mM CaCl2. Questo mezzo è utilizzato anche in una forma senza calcio, con 0,1 mM CaCl2 omesso. Preparare mezzo K+ che contiene 145 mM KCl, 5mm KOH, 10 mM HEPES, 5mm D-glucosio e 0.1% BSA.Nota: Questi mezzi sono stati ampiamente ottimizzati e sono dettagliati in precedenti pubblicazioni4,5. Preparare Stock ATP pesando abbastanza polvere di ATP per circa 20 mL di uno stock di 100 mM. Sciogliere la polvere in 17 mL di tampone di KCl (145 mM KCl, 5mm KOH e 10 mM HEPES, pH 7.5) e lentamente, continuando a mescolare, aggiungere 2 mL di idrossido di tetrametilammonio 18% (p/v) (TMA) alla soluzione per portare il pH a 6,8-7,0. Regolare il volume finale di 20 mL. Non oltrepassare il pH passato 7.0. Conservare lo stock a-80 ° C; Si noti che le aliquote di ATP sono stabili per almeno 6 mesi.Nota: Il peso molecolare libero dell’ATP anidro è 551.14 g/mol, e questo non include il peso molecolare delle molecole d’acqua e disodico, che possono variare da lotto a lotto e dovrebbero essere presi in considerazione per i calcoli. TMA è tossico, e deve prestare attenzione quando si maneggia. Leggere i dati di sicurezza foglio e preparano le scorte in un cabinet di fumi. Preparare il brodo BzATP sciogliendo il BzATP in ultrapura H2O per una concentrazione finale di stock di 10 mM. Creare una sospensione unicellulare come descritto nei passaggi 1.16 e 1.17. Contare le celle utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatico. Risospendere le cellule nel medio richiesto (ad es., Na+ medio, terreno di coltura) per l’esperimento in corso (come descritto di seguito) e mettere le celle sul ghiaccio nel frattempo. Per ogni esperimento, assicurarsi che ci sia abbastanza campione per includere controlli per dispersione avanti e laterali, nonché per la calibrazione delle impostazioni di tensione e compensazione. Si noti che, come un’indicazione, che sfere coltivate in un matraccio da T75 in genere resa circa 8 x 106 cellule per boccetta. Impostare il flusso cytometer impostazioni utilizzando campioni di controllo. Utilizzare avanti e laterali a dispersione per cancello selettivamente le cellule viventi.Nota: Forward scatter fornisce informazioni relative alle dimensioni delle cellule basato sulla diffrazione della luce, mentre la dispersione laterale fornisce una misura della complessità interna o granularità. Eventi di flusso con piccole avanti e dispersione laterale possono essere considerati come le cellule morte. Regolare la tensione e guadagno del citofluorimetro secondo le istruzioni del produttore. Eseguire un campione di prova per garantire l’acquisizione dei dati presso l’intensità di fluorescenza massima. Nessun compenso è richiesto per le acquisizioni di singolo canale. 3. afflusso del calcio di misurazione di flusso Live-cella citometria a In seguito la preparazione di una sospensione unicellulare, risospendere le cellule in 1 mL di medium di Na+ senza calcio e caricarli con 2 ng/mL di colorante indicatore del calcio secondo il protocollo del produttore (fare riferimento alla Tabella materiali) con 10 µ l 5% di acido pluronic. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C. Lavare le cellule aggiungendo 3 – 5 mL di medium di Na+ senza calcio e centrifugazione delicatamente (200 x g per 4 min). Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in medium Na+ con calcio-senza, lavare una seconda volta. Risospendere le cellule in 1 mL di medium di Na+ senza calcio, metterli sul ghiaccio e consentire loro di-esterificare per 30 min. Lavare 1 x altro aggiungendo 3 – 5 mL di terreno di K+ e centrifugazione (200 x g per 4 min); quindi, risospendere le cellule in K+ medie e aliquota loro in fluorescenza assistita cella ordinamento (FACS) tubi ad una concentrazione di 1 x 106 cellule per 500 µ l per provetta FACS.Nota: Il numero di provette di FACS per campione dipenderà il numero di trattamenti e ripete che sono inclusi. Posizionare i tubi di FACS su ghiaccio fino a quando le cellule sono pronte essere analizzati. Non lasciare le cellule sul ghiaccio per un periodo prolungato, ma iniziare l’analisi appena possibile. Per alcuni campioni, preincubate le cellule con recettore P2X7 inibitore AZ10606120 (1 µM per 10 – 15 min) o A438079 (10 µM per 30 min) a 37 ° C prima dell’analisi. Pochi minuti prima dell’esecuzione dell’esempio di primo, aggiungere CaCl2 (a una concentrazione finale di 1 mM nel tubo di FACS) e collocare la provetta nel bagnomaria a 37 ° C per recuperare. Drop un pulito, piccolo agitatore magnetico nel tubo di FACS e posizione il tubo nel modulo tempo collegata ad un bagno di acqua di 37 ° C circolanti per controllare la temperatura del campione. Selezionare una bassa velocità di agitazione per assicurare il movimento del campione senza introdurre un effetto vortice. Posizionare l’adattatore del tubo camicia d’acqua sulla piattaforma del campione e chiudere il braccio di leva della macchina FACS. Avvia acquisizione di esempio ed eseguire l’esempio per 3 min a circa 1.000 eventi al secondo. Presso il marchio s 40, rimuovere il tubo rapidamente e aggiungere l’agonista P2X7, ATP di 1 mM o 300 µM BzATP e sostituire il tubo per continuare l’acquisizione. Mentre sta registrando il primo campione, preparare il campione secondo con CaCl2 e posizionarlo a 37 ° C per consentire tempo sufficiente per le celle per riscaldarsi prima dell’analisi. Una volta che ha terminato il primo campione, pulire l’assunzione tramite l’esecuzione di un campione di acqua, e quindi l’acquisizione del secondo campione può iniziare come descritto ai punti 3.8 e 3.9. Pulire sempre l’assunzione tra i campioni. 4. formazione dei pori da citometria a flusso di cellule vive di misurazione Creare una sospensione unicellulare come descritto nei passaggi 1.16 e 1.17. Salvare pochi millilitri del vecchio mezzo, utilizzarlo per risospendere le cellule ad una concentrazione di 1 x 106 cellule per 100 µ l per provetta FACS e posizionarlo sul ghiaccio fino al momento. Prima di eseguire il test, è necessario aggiungere 900 µ l di terreno di K+ per un volume finale di 1 mL e posizionare le provette in bagnomaria a 37 ° C per 10 min recuperare. Se applicabile, preincubate le cellule con trattamenti, tra cui gli inibitori specifici P2X7 AZ10606120 (1 µM per 10 – 15 min) o A438079 (10 µM per 30 min). Immediatamente prima di eseguire il test, aggiungere il bromuro di etidio 25 µM per il tubo di FACS; quindi, aggiungere l’agitatore magnetico, posizionarlo sulla macchina FACS secondo passo 3.7 e iniziare l’acquisizione.Nota: Il bromuro di etidio è tossico, e deve prestare attenzione nel maneggiarlo. Smaltire in modo appropriato tubi usati FACS. Per indurre la formazione di pori nella membrana cellulare, aggiungere 1 mM ATP o 100 µM BzATP 40 s dopo l’inizio dell’acquisizione. Eseguire gli esempi a circa 1.000 eventi al secondo per 6 min. Mentre è in esecuzione il primo campione, prendere il secondo campione dal ghiaccio e metterlo nel bagno d’acqua di 37 ° C per consentire tempo sufficiente per le cellule di recuperare prima dell’analisi. Una volta che il primo campione ha finito con l’acquisizione, pulire l’assunzione tramite l’esecuzione di un campione di acqua; poi, nel secondo esempio può essere collocato sulla macchina per iniziare la registrazione come descritto ai punti 3.8 e 3.9. 5. misurazione della fagocitosi da citometria a flusso di cellule vive Creare una sospensione unicellulare come descritto nei passaggi 1.16 e 1.17. Risospendere le cellule in medium condizionato e aliquota in FACS tubi ad una concentrazione di almeno 1 x 106 cellule per 100 µ l per provetta FACS. Diluire le cellule ad una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/mL con il mezzo di Na+ (ad esempio, aggiungere 900 µ l di terreno di Na+ ) e inserire le celle su ghiaccio fino a quando l’analisi viene eseguita. Utilizzare 1 µm di granuli di lattice YG (microsfere) come obiettivi fagocitici per i test di fagocitosi in tempo reale.Nota: Altri colori possono anche essere sostituiti, ma perle di diverse dimensioni sono stati trovati per essere obiettivi inadeguati di fagocitosi4. Prima di eseguire il primo campione, trasferire le cellule a bagnomaria a 37 ° C ed incubare per circa 7-10 min consentire alle cellule di recuperare. Aggiungere eventuali trattamenti che richiedono la preincubazione ai loro rispettivi tubi, tra cui 1 mM ATP per 15 min, 300 µM ossidato ATP (oxATP) per 40 min, 20 µM Citocalasina D per 20 min e paraformaldeide al 4% (PFA) per 20 min. Nessun preincubazione è richiesta per il 5% di siero umano. Se i trattamenti vengono aggiunti all’incirca alla stessa ora, i campioni possono essere eseguiti in ordine inverso mentre gli altri continuano a incubare. Ad esempio, eseguire i controlli e siero in primo luogo, quindi il campione ATP-trattato, seguito da Citocalasina D e PFA e oxATP Ultima. Mettere il campione sul citometro con agitatore magnetico come descritto ai punti 3.8 e 3.9 e, quindi, Avvia acquisizione del campione. Rimuovere la provetta dalla macchina 15 – 20 s dopo l’inizio dell’acquisizione e aggiungere 5 µ l di perline YG non diluiti. Tornare nella provetta di FACS e continuare l’acquisizione. Eseguire gli esempi per 7 – 8 min a circa 1.000 eventi/s. Mentre è in esecuzione il primo campione, prendere il secondo campione dal ghiaccio e metterlo in un bagnomaria a 37 ° C per consentire tempo sufficiente per le cellule di recuperare prima dell’analisi. Una volta che è finito il primo campione, pulire l’assunzione eseguendo un campione d’acqua e, quindi, iniziare acquisizione sul secondo campione come descritto ai punti 3.8 e 3.9. 6. analisi dei dati Esportare i dati in un foglio di calcolo. L’analisi dei dati dipenderà la questione sperimentale.Nota: Essere consapevoli del fatto che su piste diverse possono avere intensità diversa della linea di base, quindi è importante eseguire il test di prova per un tempo designato all’inizio (circa 40 s) prima di aggiungere qualsiasi agonisti e per normalizzare i dati calcolando la variazione di fluorescenza (la fluorescenza in un determinato punto di tempo [F] diviso per la fluorescenza a tempo punto zero [F0] o F/F0). Per quantificare il tasso o la cinetica della funzione P2X7 in questione, calcolare l’area sotto la curva o la somma dei trapezi creato sotto la curva per ogni periodo di tempo s 1016. Per determinare gli effetti dei trattamenti, in media l’intensità di fluorescenza sopra la s finale 10 – 20 della registrazione e confrontare i trattamenti. Determinare il significato di t-test o analisi della varianza.