JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia dello sviluppo

Cytometry זרימה לחיות תאים בזמן אמת כדי לחקור סידן זרם היווצרות נקבובית, Phagocytosis על ידי רצפטורים P2X7 ובתאים עצבית למבוגרים

Published: April 03, 2019
doi:
10.3791/59313
, , , , ,
1Griffith Institute for Drug Discovery,Griffith University, 2Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology,University of Queensland, 3Discipline of Anatomy and Histology, School of Medical Science,University of Sydney, 4Bosch Institute,University of Sydney, 5Applied Neurosciences Program, Peter Duncan Neurosciences Research Unit,St. Vincent’s Centre for Applied Medical Research, 6School of Medical Sciences,The University of New South Wales (UNSW) Medicine, Sydney, New South Wales, 7School of Environment and Science,Griffith University, Brisbane, Queensland, 8Florey Institute of Neuroscience and Mental Health,University of Melbourne

Summary

מתן רגישות מתא בודד, cytometry זרימה בזמן אמת הוא לצורכיכם לכמת קולטן עם מודאלים מרובים פונקציות של תרבויות חיים. באמצעות ובתאים עצבית למבוגרים, הפונקציה קולטן P2X7 הוערכה באמצעות זרם סידן זוהה על ידי סידן אינדקטור, היווצרות נקבובית transmembrane על-ידי אתידיום ברומיד ספיגת ולאחר phagocytosis באמצעות חרוזים לייטקס פלורסנט.

Abstract

Cytometry זרימה לחיות תאים משמשת יותר ויותר בקרב הביולוגים תא לכמת תהליכים ביולוגיים ב להתפרנס תרבית תאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לפיה cytometry זרימה לחיות תאים מורחב על כדי לנתח את פונקציות מרובות של הפעלת קולטן P2X7 בזמן אמת. באמצעות מודול זמן מותקן על cytometer זרימה, לחיות תאים יכול להיות מוערך ופונקציונליות המותווים לאורך זמן נתון כדי לחקור את קינטיקה של סידן זרם, היווצרות transmembrane נקבובית phagocytosis. שיטה פשוטה זו יש יתרון כל שלוש פונקציות הקנוני של הקולטן P2X7 יכול להיות מוערך באמצעות מכונה אחת ולאחר שנאספו הנתונים שמותווים לאורך זמן מספק מידע על כל אוכלוסיית תאים חיים ולא הקלטות מתא בודד לעיתים קרובות להשיג בשיטות התיקון-קלאמפ טכנית מאתגר. סידן זרם ניסויים להשתמש צבע מחוון סידן, בעוד P2X7 נקבובית היווצרות מבחני להסתמך על אתידיום ברומיד מורשה לעבור transmembrane הנקבוביות בנוי על ריכוזים גבוהים אגוניסט. צהוב וירוק (YG) חרוזים לייטקס מנוצלים כדי למדוד phagocytosis. אגוניסטים ספציפיים, היריבים מוחלים לחקור את ההשפעות של פעילות הקולטן P2X7. בנפרד, שיטות אלה יכול להיות שונה כדי לספק נתונים כמותיים על כל מספר של ערוצי סידן, רצפטורים purinergic, אוכלי נבלות. יחדיו, הם מדגישים כיצד השימוש של cytometry זרימה לחיות תאים בזמן אמת היא שיטה מהירה, חסכונית, הדירים לכימות לחקור פונקציה הקולטן P2X7.

Introduction

המחקר של purinergic איתות הוא רחב ואת הגיוון הרב, מעורבים פיסיולוגיה תאית, ביוכימיה, פרמקולוגיה. Purinergic איתות מעורב מספר אינסופי של תהליכים תאית ומולקולרית, סרטן ורגולציה מחזור התא תא-תא תקשורת, ביולוגיה של התא גזע; ככזה, לעיתים קרובות קיים פוטנציאל לווסת purinergic איתות על יתרון טיפולית. של קולטני purinergic, קיבלה קולטן P2X7 תשומת לב משמעותית בשנים האחרונות בגלל הפוטנציאל בתור מטרה טיפולית במצבים דלקתיים רבים1. שיטות ללמוד את הקולטן התפתח, הייתי הותאם במשך השנים כדי להקל על זה מחקר2,3,4,5. כאן, אנו מתארים שיטה cytometry זרימה לחיות תאים לחקור פונקציות מרובות של רצפטורים P2X7 למבוגרים עצבית ובתאים נגזר אזור subventricular (SVZ), הכישור משוננת בהיפוקמפוס.

הקולטן P2X7 תוארה לראשונה את הקולטן P2Z, או הקולטן ‘מוות התא’, כמו שלה הפעלה עם ריכוזים גבוהים של אדנוזין טריפוספט (ATP) תוצאות על היווצרות נקבובית transmembrane גדול חדיר כדי מולקולות ועד 900 Da6. זה מוביל cytoskeletal התארגנות מחודשת, היווצרות נקבובית transmembrane, ו-, באופן פוטנציאלי, אפופטוזיס ו/או נמק7. באופן מסורתי, פונקציה זו של P2X7 הוא לכמת על ידי ספיגת של צבעי משקל מולקולרי גדול כגון יו-PRO-1 או אתידיום ברומיד, אשר לזרוח כאשר intercalated עם ה-DNA3,8. צלחת קורא שיטות, אשר מהיר ו המאפשרים upscaling, בדרך כלל אינם מאפשרים התבוננות קינטיקה. השיטה המתוארת כאן מבוסס על ספיגת אתידיום ומאפשר העלייה פלורסצנטיות להיות נצפתה לאורך זמן, מתן לעומק גדול יותר של מידע לגבי המהירות היווצרות הנקבובית. מאז כבר הראו קולטנים P2X7 כדי להקל על מספר פונקציות nonimmune, עם תגובות שונות בהתאם לחשיפה אגוניסט וזמן ריכוז9,10. הפעלה קצרה על ידי ריכוז נמוך יותר של ATP תוצאות הקטיון זרם למטרות של התמרה חושית עצבי ושידור11. באמצעות מיכשור למדידת זרם סידן מתגבר על הבעיות הקשורות שיטות מסורבל ומאתגרים מבחינה טכנית – במיוחד, תיקון מחבר חובק למעקה למדידת זרמים פנימה אשר מספקים פרטים שלא יסולא בפז על השינוי בפוטנציאל, לרוחב קרום התא, אבל אינם מאפשרים את האוכלוסייה ניתוח2. הפונקציה השלישית של קולטני P2X7 מתרחשת בהיעדר ATP, איפה P2X7 קולטני הוכחו כדי לסייע phagocytosis המערכת החיסונית והן את מערכת העצבים9,12,13. החידושים טכניקות במיקרוסקופ אפשרו את החזיית cytoskeletal rearrangements במהלך תהליך ספיגת, למרות ניתוח כימות והאוכלוסיה עדיין יכול להציג לאתגר.

השיטה cytometry זרימה לחיות תאים מפורט כאן מאפשר החקירה של כל שלוש פונקציות עיקריות של קולטני P2X7 בזמן אמת. ההכללה של התקן מודול זמן על cytometer זרימת מאפשר בקרת טמפרטורה ערבוב מתמיד של תאים ההשעיה. גירויים אגוניסט, אנטגוניסט יכולים להינתן בתוך שנייה, המאפשר מדידת ללא הפרעה ליד התגובה התאית. זה מציג שיטה מהירה פשוטה reproducibly לכמת פונקציה תוך הימנעות את השימוש במערכות מרובות וזמינותו. חשוב לציין כי פרוטוקול זה עשוי להתאים בקלות כדי להתאים לכל סוג התא יכול לשמש כדי לבחון אחרים תת הקולטן בהתחשב ההכללה של אגוניסטים ספציפיים או מעכבי, בהתאם המאפיינים שלהם.

Protocol

בעלי חיים היו מטופלים לפי קוד האוסטרלי של התרגול על טיפוח ועל שימוש של בעלי חיים למטרות מדעיות, שאושרו לשימוש על-ידי ועדת האתיקה חיה באוניברסיטת גריפית. 1. Neurosphere תרבות של ובתאים עצבית SVZ למבוגרים, ההיפוקמפוס הערה: פרוטוקול לנתיחה המובאת כאן המבוסס על עבודה על-ידי ווקר Kempermann, עבור ניתוח ובתאים עצבית של עכברים בוגרים פרוטוקול מפורט זמין במקומות אחרים14. תרבות התנאים השתנו באבו ועמיתיו15. למבוגרים עכברים C57BL/6 נשים בגילאי 8-12 שבועות שימשו. ב- cabinet בטיחות ביולוגית, להכין המדיום תרבות (בינוני הבזליים עצבית) עם תוספת התפשטות תאי גזע עצביים, גלוטמין 2 מ מ, 20 ng/mL גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), ng/mL 10 בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF) ו- 2 µg/mL הפארין. המתת חסד שני עכברים באמצעות אינהלציה2 CO. לחלופין, עזים ומתנגד העכברים בהתאם להנחיות מוסדיים, מיד להרדימם מאת נקע בצוואר הרחם. לרסס את ראשיהם עם 70% אתנול, לכרות אותם. העברת כל ראש צינור סטרילי המכיל של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) עם x 1 פניצילין/סטרפטומיצין פתרון (P/S). ביצוע ניתוח תא למינארי תחת מיקרוסקופ לנתיחה. באמצעות מלקחיים, חיתוך מספריים, להסיר רקמות ועצמות לחשוף את המוח, ולא להעביר אותו תבשיל סטרילי המכיל HBSS עם P/S. מקם את הצד הגחוני של המוח למעלה ולהשתמש להב סכין בביצוע חתך הילתית מלאה בכל הצנטר. תחזיק את המוח יציב עם המלקחיים והשתמש באחת מהיר, נקי, תנועה כלפי מטה. הימנע ניסור כדי למזער את מות תאים וכדי לסייע לשמור על מבנה רקמות.הערה: אם לא נערך באופן מאובטח, המוח יכול להטות קדימה במהלך גזירה, להתפשר על מספר ובתאים המתקבל SVZ. לבודד את SVZ מהמחצית rostral של המוח. אתר בשני החדרים, המופרדים במחיצה, עם כפיס המוח יצירת גשר לבן מעליהם. להשתמש מלקחיים כדי להסיר מחצה להפריד את שתי עליות ולבודד את הקירות הצדדיים של החדרים הצדדיים הקדמי. לעשות זאת על ידי חיתוך משם מעל, מתחת, לצדדים, בחזית במספריים לנתיחה משובחים. יישארו רק צורה דמוי ספל קטן. להכין שקית נקי צלחת פטרי עם כמה טיפות של HBSS באמצע, להעביר SVZ את הנוזל. אל תאפשר את הרקמה להתייבש או לגעת משטח יבש. לעמוד בצד בזמן לנתח את hippocampi. לבודד את hippocampi מהמחצית סימטרית של המוח. להפוך את קו האמצע לחתוך בין ההמיספרות לנתק את כפיס המוח. החדרים הצדדיים כעזר וללא בעדינות את קליפת לחשוף את ההיפוקמפוס. ברגע קליפת המוח כבר unrolled, ההיפוקמפוס ניתן לראות מבנה צפוף, לבן, מעוקל. השתמש בסדר חיתוך מספריים או מלקחיים כדי לבודד ההיפוקמפוס מן הרקמות השכנות. עם מלקחיים, להסיר עודפי חומר לבן, כלי הדם ואת כל רקמות עלי הלוואי קרומיים כיסוי ההיפוקמפוס. להכין מכסה נקי צלחת פטרי עם כמה טיפות של HBSS, ההיפוקמפוס להעביר הנוזל. חזור על הכדור השני. לאחר ההיפוקמפוס, את SVZ של שני עכברים מבודדים, הועבר העפעפיים שלהם בהתאמה פטרי, מכנית הקוביות הרקמה באמצעות סכין ומהדקים. קוצצים את הרקמה ב אחד מכסה פטרי כ 1 דקות, סיבוב כל s להופעת רקמת חלקה 10 חתיכות קנס רק להישאר. לקחת סכין נקי האזמל וחזור עבור המנה אחרים, תודה, ריק הרקמה 1 דקות. באמצעות פיפטה של 1 מ”ל, להעביר את כל הרקמה המכסה כל צלחת פטרי כדי להפריד בין צינורות המכיל 1 מ”ל של 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). להשתמש שפופרת אחת את SVZ, שפופרת אחת עבור ההיפוקמפוס. לעשות זאת באמצעות pipetting הראשונה כמחצית טריפסין-EDTA לרקמת בצלחת כדי למזער את בועות האוויר, כדי למנוע את הרקמה לבוא במגע עם הטיפ פיפטה יבש כמו זה הועבר ברכבת התחתית. יש לשטוף את המנה, הלהב האזמל עם שאר טריפסין-EDTA כדי לאסוף כמה שיותר רקמות ככל האפשר להוסיף את הצינור. דגירה הרקמה עם טריפסין באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לזעזע את הצינור כל 10 דקות כראוי מביצועם הרקמה. Triturate הרקמה באמצעות זכוכית מלוטשים אש פסטר פיפטה ליצירת השעיה תא בודד. הקפידו לא overtriturate כמו זה יגרום פירוק התא מוגזמת. זהו צעד קריטי עבור דיסוציאציה רקמות אופטימלית. לבחון את תוכן צינור במהלך תהליך trituration, עוצרות הסימנים המוקדמים כי הרוב המכריע של רקמות גושים הוסרו. הפתרון טריפסין צריך להיות מעט מעוננים כאשר התאים נעלמו לתוך תא בודד ההשעיה, למרות כמה גושים עשויים להישאר.הערה: כאינדיקציה, עובר את המתלים לאורך 10 x-15 x מספיקה. להוסיף תרבות בינוני עד 5 מ”ל כדי לנטרל את טריפסין, ספין-300 x גרם במשך 3 דקות לשטוף נוספים 2 x עם HBSS ומעביר המדיום דרך מסננת תא מיקרומטר 70 כדי להסיר את כל רקמות מתגבש. העברת כל התאים באזור 15 מ”ל של מדיום בקבוקון תרבות T75 התא.הערה: הספירות צריך טופס במעבר אפס (P0) התרבות SVZ לאחר 7-10 ימים לאחר 15-20 ימים בתרבות בהיפוקמפוס. להימנע כביסה או האכלה התאים במהלך תקופה זו כדי למקסם את מספר ובתאים עצבית בתרבות. אם אבות נוספים נדרשים, או כדי להקטין את זמן הדגירה P0, זה ניתן להגדיל את מספר עכברים הקריב. לשמור על תרבויות ב 37 ° C עם 5% CO2 ו, לאחר השלב הראשוני של תרבות P0, המעבר כל 7-10 ימים במקרה הצורך, באמצעות שיטות התרבות רקמות ארון סטנדרטי של בטיחות ביולוגית.הערה: התרבות בהיפוקמפוס P0 צריכה לייצר מספיק לספירות מעבר לתוך בקבוקון T25; התרבות SVZ יפיק בתחומים נוספים רבים, יכול להיות passaged לתוך T75. אם הכדורים P0 בהיפוקמפוס יש דבקה, להשתמש פיפטה 200 µL ותוציאי בעדינות לספרה. המעבר את הכדורים כשהם מגיעים 150-200 מיקרומטר בקוטר. לאסוף את הספירות בינוני בשפופרת 15 מ”ל ולאפשר את הכדורים להתפשר על ידי הכבידה על 5 דק. לחלופין, לסובב במהירות נמוכה (100 x g) למשך 2 דקות. הסר את המדיום, מביצועם התאים עם דיסוציאציה ריאגנט במשך 7-10 דקות, בהתאם לגודל הספירות.הערה: דיסוציאציה הכימית משמש יהיו תופעות משמעותיות על התוצאה של התרבות, אז נא לפנות השולחן של חומרים לקבלת פרטים אודות. לשטוף התאים על-ידי הוספת 5 מ של HBSS ה תא פתרון ל צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות להסיר את תגובת שיקוע resuspend התאים במדיום תרבות, זרע-תאים כ 150,000 מ של מדיום T25 תא תרבות הבקבוק או שווה ערך. לשמור על התרבויות-CO 37 ° C ו-5%2. אשר מצב תא קדמון עצבית על ידי זיהוי הביטוי של תאי גזע סמנים כגון Sox2 ו- ASCL1 לפני שתמשיך כל פרוטוקול במורד הזרם9.הערה: זה יכול להיעשות על ידי השיטה המועדפת של החוקר (למשל, נוגדנים על ידי מיקרוסקופ, cytometry זרימה או תספיג חלבון, או באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR)). 2. הכנה של השעיה בתא יחיד לניתוח על ידי Cytometry זרימה הכינו את מדיה הנדרשים. אלה כוללות את הפעולות הבאות. להכין Na+ בינוני המכיל 145 מ”מ NaCl, 5 מ מ KOH, 10 מ מ HEPES, 5 מ מ D-גלוקוז, 0.1% אלבומין שור (BSA), ו 0.1 מ”מ CaCl2. בינוני משמש גם בצורה נטולת סידן, עם 0.1 מ”מ CaCl2 מושמט. להכין K+ בינוני המכיל 145 מ”מ אשלגן כלורי, 5 מ מ KOH, 10 מ מ HEPES, 5 מ מ D-גלוקוז ו 0.1% BSA.הערה: מדיה אלה אופטימציה בהרחבה, מפורטת פרסומים קודמים4,5. הכן מניות ATP על ידי שקילה מספיק אבקת ATP עבור בסביבות 20 מ”ל של מלאי 100 מ מ. להמיס את האבקה בתוך 17 מ של מאגר אשלגן כלורי (145 מ מ אשלגן כלורי, 5 מ מ KOH, ו- 10 מ מ HEPES, pH 7.5) ולהוסיף לאט לאט, תוך כדי ערבוב, 2 מ של 18% (w/v) tetramethylammonium הידרוקסיד (TMA) הפתרון כדי להביא את ה-pH 6.8 – 7.0. לכוון את עוצמת הקול הסופי 20 מ. לא להחטיא את ה-pH בעבר 7.0. לאחסן את המניה ב-80 מעלות צלזיוס; שימו לב כי aliquots ATP יציבה במשך לפחות 6 חודשים.הערה: המשקל המולקולרי חינם של ATP נטול מים 551.14 g/mol, זה לא כולל את המשקל המולקולרי של מולקולות מים, ניתרן, אשר עשוי להשתנות אצווה כדי אצווה צריכה להילקח בחשבון על החישובים. TMA רעיל, יש לנקוט בעת הטיפול. לקרוא נתוני בטיחות גיליון ולהכין את המניות בארון fume. להכין מלאי BzATP על ידי המסת את BzATP הנדסה גנטית H2O עבור ריכוז מלאי סופי של 10 מ מ. ליצור השעיה תא בודד כפי שמתואר בשלבים 1.16 ו- 1.17. לספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה תא אוטומטית. Resuspend התאים המדיום הדרושים (למשל, בינוני Na+ , תרבות בינוני) לניסוי שהודעתו (כמפורט להלן) ומניחים את התאים על הקרח בינתיים. עבור ניסוי, ודא שיש מספיק הדגימה כדי לכלול פקדים פיזור קדימה ואת הצד, כמו גם הכיול של מתח והגדרות פיצוי. שימו לב, כאינדיקציה, כי הספירות גדל בקבוקון T75 בדרך כלל תשואה בסביבות 8 x 106 תאים לכל את הבקבוק. הגדר הזרימה cytometer הגדרות באמצעות דגימות הבקרה. שימוש קדימה וצד פיזור לשער באופן סלקטיבי את תאי החי.הערה: פיזור הקדמי מספק מידע לגבי גודל תא, המבוסס על שבירת אור, בעוד הצד פיזור מספק מידה של מורכבות פנימית או צפיפות. אירועים זרימה עם פינה ופיזור צד עשוי להיחשב תאים מתים. התאם את המתח ולהשיג של cytometer הזרימה על פי הוראות היצרן. הפעל מדגם משפט כדי להבטיח לכידת נתונים במהירות עוצמת קרינה פלואורסצנטית המרבי. פיצוי נדרש עבור רכישות ערוץ אחד. 3. מדידה את זרם סידן על ידי תאים חיים לזרום Cytometry בעקבות הכנת השעיה מתא בודד, resuspend תאי 1 מ”ל נטולת סידן בינוני Na+ , לטעון אותם עם 2 ננוגרם למ”ל של סידן אינדקטור לפי הפרוטוקול של היצרן (עיין טבלה של חומרים) עם 10 µL של 5% חומצה pluronic. דגירה התאים למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים על ידי הוספת 3-5 מ ל נטולת סידן בינוני Na+ צריך שתוציאו בעדינות (200 x גרם במשך 4 דקות). הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים נטולת סידן בינוני Na+ , שטיפה פעם נוספת. Resuspend תאי 1 מ”ל נטולת סידן בינוני Na+ , למקם אותם על קרח, לאפשר להם לבטל את esterify למשך 30 דקות. לשטוף 1 x יותר על-ידי הוספת 3-5 מ ל K+ בינוני, צריך שתוציאו (200 x g למשך 4 דקות); לאחר מכן, resuspend תאי K+ aliquot ובינוניות אותם לתוך קרינה פלואורסצנטית תא בסיוע מיון (FACS) צינורות-ריכוז של עונה 1 פרק 106 תאים לכל µL 500 למחזור FACS.הערה: המספר של צינורות FACS לדגימה יהיה תלוי מספר הטיפולים וחוזר זה הינם כלולים. במקום הצינורות FACS על הקרח עד התאים מוכן להיות מנותח. אין להשאיר את התאים בקרח לתקופה ממושכת אך מתחילים וזמינותו בהקדם האפשרי. עבור דוגמאות, preincubate את התאים עם מעכב קולטן ספציפי P2X7 AZ10606120 (1 מיקרומטר למשך 10-15 דקות) או A438079 (10 מיקרומטר למשך 30 דקות) ב 37 מעלות צלזיוס לפני ניתוח. כמה דקות לפני הפעלת המדגם הראשון, להוסיף CaCl2 (ריכוז סופי של 1 מ מ בצינור FACS) ומניחים את הצינורית בתוך אמבט מים 37 ° C כדי לשחזר. ושחרר נקייה, פגים קטנים לתוך צינור FACS ואת מיקום הצינור במודול הזמן קשורה באמבט מים במחזור 37 ° C כדי לשלוט הטמפרטורה מדגם. בחר מהירות מלהיב נמוך כדי להבטיח תנועה של המדגם ללא היכרות עם אפקט מערבולת. מקם את מתאם צינור מים הז’קט על הפלטפורמה מדגם וסגור את זרוע מנוף של המכונה FACS. ליזום דוגמת רכישה ולהפעיל את הדגימה למשך 3 דקות באירועים בסביבות 1000 לשניה. -הסימן s 40, במהירות להסיר את הצינור ולהוסיף אגוניסט P2X7, 1 מ מ ATP או מיקרומטר 300 BzATP, ולהחליף את הצינור להמשך הרכישה. בעוד המדגם הראשון הוא מקליט, הכנת המדגם השני עם CaCl2 ולמקם אותו ב- 37 ° C כדי לאפשר מספיק זמן עבור התאים להתחמם לפני ניתוח. ברגע המדגם הראשון הסתיים, מנקה צריכת על-ידי הפעלת דגימת מים, ולאחר מכן רכישת המדגם השני יכול להתחיל כפי שתואר בשלבים 3.8 ו- 3.9. תמיד מנקה צריכת בין הדגימות. 4. מדידת נקבובית היווצרות מאת Cytometry זרימה לחיות תאים ליצור השעיה תא בודד כפי שמתואר בשלבים 1.16 ו- 1.17. להציל כמה מיליליטר של המדיום הישן, להשתמש בו כדי resuspend את התאים-ריכוז של עונה 1 פרק 106 תאים לכל 100 µL למחזור FACS, ומניחים אותו על הקרח עד מוכן. לפני הפעלת וזמינותו, הוסף 900 µL K+ בינוני עבור אמצעי אחסון הסופי של 1 מ”ל ולמקם הצינורות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להתאושש. אם רלוונטי, preincubate את התאים עם טיפולים, כולל את מעכבי ספציפי P2X7 AZ10606120 (1 מיקרומטר למשך 10-15 דקות) או A438079 (10 מיקרומטר למשך 30 דקות). מיד לפני הפעלת וזמינותו, להוסיף 25 מיקרומטר אתידיום ברומיד הצינור FACS; לאחר מכן, הוסף את פגים, למקם אותו על המכונה FACS לפי שלב 3.7, ובו מתחילות הרכישה.הערה: אתידיום ברומיד הוא רעיל, יש לנקוט בעת טיפול זה. תשליך צינורות FACS בשימוש כראוי. כדי לגרום להיווצרות נקבוביות קרום התא, להוסיף 1 מ מ ATP או 100 מיקרומטר BzATP 40 s כבר לאחר הרכישה. הפעל את הדגימות באירועים בסביבות 1000 לשנייה במשך 6 דקות. בזמן המדגם הראשון פועל, לקחת את הדגימה השנייה מן הקרח ומניחים אותו באמבט מים 37 ° C כדי לאפשר מספיק זמן עבור התאים להתאושש לפני הניתוח. ברגע המדגם הראשון מסתיים עם רכישת, מנקה צריכת על-ידי הפעלת דגימת מים; לאחר מכן, ניתן להניח המדגם השני על המכונה להתחיל את ההקלטה כפי שתואר בשלבים 3.8 ו- 3.9. 5. מדידת Phagocytosis מאת Cytometry זרימה לחיות תאים ליצור השעיה תא בודד כפי שמתואר בשלבים 1.16 ו- 1.17. Resuspend התאים הממוזגים בינונית, aliquot אותם לתוך FACS צינורות-ריכוז של פחות 1 x 106 תאים לכל 100 µL למחזור FACS. לדלל את התאים כדי ריכוז סופי של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל נה+ בינונית (למשל, הוסף 900 µL Na+ בינוני) ומניחים את התאים על הקרח עד הניתוח מתבצע. השתמש 1 מיקרומטר של חרוזים לייטקס YG (microspheres) כמטרות phagocytic עבור מבחני phagocytosis בזמן אמת.הערה: גם יכול להיות מוחלף צבעים אחרים, אך החרוזים בגודל שונה נמצאו מטרות לקוי של phagocytosis4. לפני הפעלת המדגם הראשון, להעביר את התאים באמבט מים 37 ° C, דגירה אותם במשך כ 7-10 דקות לאפשר את התאים להתאושש. הוסף כל טיפולים הדורשים preincubation אל צינורות בהתאמה שלהם, כולל 1 מ מ ATP למשך 15 דקות, 300 מיקרומטר מחומצן ATP (oxATP) למשך 40 דקות, cytochalasin מיקרומטר 20 יח 20 דקות, 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 20 דקות. אין preincubation נדרש עבור 5% בנסיוב אדם. אם טיפולים נוספים בערך באותו זמן, הדגימות ניתן להפעיל בסדר הפוך בזמן שהאחרים ימשיכו דגירה. לדוגמה, הפעל את הפקדים סרום קודם, ואז המדגם שטופלו ATP, ואחריו cytochalasin D מחברים, ואת oxATP האחרון. במקום המדגם על cytometer עם פגים כפי שתואר בשלבים 3.8 ו- 3.9 וליזום, ואז, דוגמת רכישה. להסיר הצינור מדגם מהמכונה 15 – 20 s כבר לאחר הרכישה, וכן להוסיף 5 µL של חרוזים YG מדולל. להחזיר את הצינור FACS מדגם ולהמשיך הרכישה. הפעל את הדגימות למשך 7-8 דקות-אירועים בסביבות 1000/s. בזמן המדגם הראשון פועל, לקחת את הדגימה השנייה מן הקרח ומניחים אותו בתוך אמבט מים 37 ° C כדי לאפשר מספיק זמן עבור התאים להתאושש לפני ניתוח. ברגע הדגימה הראשונה הסתיימה, מנקה צריכת על-ידי הפעלת דגימת מים ו, אז, מתחילים רכישה על הדגימה השנייה כפי שתואר בשלבים 3.8 ו- 3.9. 6. ניתוח נתונים יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני. ניתוח הנתונים תהיה תלויה השאלה ניסיוני.הערה: להיות מודע כי הפעלות שונות יכול להיות בעוצמות שונות בסיסית, ולכן חשוב להפעיל את הבדיקה לזמן המיועד בתחילתו (40 s) לפני הוספת כל אגוניסטים ו כדי לנרמל את הנתונים על-ידי חישוב השינוי בקרינה פלואורסצנטית (ידי קרינה פלואורסצנטית בכל נתון נקודת זמן [F] מחולקים על ידי קרינה פלואורסצנטית בנקודת זמן אפס [F0], או F/F0). כדי לכמת את שיעור או קינטיקה של הפונקציה P2X7 המדובר, לחשב את השטח מתחת לעקומה או סכום trapezoids שנוצרו תחת עקומת עבור כל 10 s זמן מחזור16. כדי לקבוע את ההשפעה של טיפולים, ממוצע עוצמת קרינה פלואורסצנטית מעל ה s 10 – 20 הסופי של הקלטה ולהשוות את הטיפולים. לקבוע את המשמעות על ידי t-test או השונות.

Representative Results

תרביות תאים עצביים קדמון קדמון עצבית כדור תרבויות נגזר בשיטה זו צריך להיות שלב בהיר ויש קצה עגול חלק (איור 1 א’ב’). בתרבויות בריא, microspikes קטן יכול להיות שנצפו על הקצוות (איור 1C). -מעברים מאוחר, או אם מוזן כראוי, כדורים יכולים ליצור צורת גביע חלול (איור 1D) או צורות מלבני גדול (איור 1E, שמסומן על ידי החץ). תרבויות אלה לא אמור לשמש עבור cytometry זרימה או במורד יישומים אחרים, כמו תכונות אלה ייתכן מעידה על בידול. כדי לוודא את מצב קדמון עצבית, מצופים בתאים על coverslips זכוכית דקה מצופה עם פולי-L-ornithine, laminin עבור immunocytochemistry (איור 1F ו, ב confluency גבוה יותר, איור 1 ג’י). התאים היו מוכתם GFAP, nestin, Sox2 vimentin, ASCL1, BLBP, Prox1, DCX לזהות התאים ובתאים סוג 2 (היפוקמפוס) או סוג C קדמון תאים (SVZ)9. תאים צריך להיות גרעין מוגדר היטב ותהליכים המורחבת. איור 1: תרבית תאים נציג קדמון עצביים בהיפוקמפוס. בהיפוקמפוס עצבית של (A) ובתאים מבודדים של עכברים בוגרים, תרבותי כמו neurospheres עד כ- 100 עד 150 מיקרומטר בקוטר. Neurospheres (B) צריך להיות של הפריפריה חלקה, (ג) ו- microspikes קטן יכול להיות שנצפו על פני השטח שלהם. כאשר כדורים ארוכים מדי בתרבות, הם יכולים ליצור גביע (D) או צורות מלבני (E). תרבויות אלה לא אמור לשמש לניסויים. כדי לוודא את מצב קדמון עצבית של התאים, זרע אותם כמו השעיה תא בודד על פולי-L-ornithine (אש ף), coverslips זכוכית מצופים laminin דקה של נוגדנים. תאים צריך של סומא קטן ותהליכים מסעף, (F) confluency נמוכה, (G) מוכן נוגדנים. גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. זרם סידן על ידי cytometry זרימה לחיות תאים פרוטוקול זה מאפשר הניתוח של הפונקציה קולטן P2X7 כערוץ סידן בזמן אמת. את קינטיקה של קולטן פונקציה, כמו גם את ההשפעות של אגוניסטים שונים antagonists, יכול גם להיות מוערך. כאשר המותוות לאורך זמן, סידן זרם ב בהיפוקמפוס, עצביות SVZ ובתאים היה דומה כלל (איור 2A ו- 2B איור, בהתאמה). אגוניסטים (ATP או BzATP), התווספו הסימן s 40, כפי שמציין החץ האדום. לשבריר שנייה, יוסר הצינור מנקודת הקלטה להוספת אגוניסט, וכתוצאה מכך נקודות הנתונים של אפס. זה יאפשר זיהוי הזמן כאשר נוספה אגוניסט. BzATP במהירות מפעיל רצפטורים P2X7, לפתוח את תעלת יונים ומאפשר זרם סידן, אשר נקשר Fluo-8 שזוהר. ATP יישום התוצאה בדרך כלל זרם יותר הדרגתית סידן. יש זיקה נמוכה יותר של P2X7 בהשוואה BzATP, והוא גם תוצאה של קולטן G-חלבון בשילוב הפעלה, מסלול איתות לאט יותר, אשר משחרר סידן מן רשתית תוך-פלזמית. ההכללה של היריבים P2X7 A438079 ו- AZ10606120 (נתונים לא מוצג) מופחת זרם סידן בתגובה אגוניסט היישום. איור 2: לחיות תאים זרם סידן ב ובתאים עצביים בהיפוקמפוס, SVZ. P2X7 קולטן סידן ערוץ פונקציה הודגם ב (א) בהיפוקמפוס, (B) נגזר SVZ ובתאים בשערי פלורסצנטיות Fluo-8. יישום של כללי אגוניסט P2X ATP והתוצאה P2X7 אגוניסט BzATP בערוצים יון P2X7 פתיחה, ומאפשר זרימה סידן. זרם נחסם עם מעכבי P2X7 ספציפית A438079 או AZ10606120 (נתונים לא מוצג). F = קרינה פלואורסצנטית; F0 = קרינה פלואורסצנטית בנקודת זמן אפס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. היווצרות נקבובית מאת cytometry זרימה לחיות תאים היווצרות נקבובית transmembrane היא תכונה הקנוני של רצפטורים P2X7, תוצאות המרת מקרומולקולה, והוא יכול להוביל מוות של תאים. אתידיום+ הוא מולקולה גדולה (314 Da) נכללו תאים בריאים; ספיגת שלה, העיבור הבאים עם ה-DNA תוצאות פליטת פלורסנט, ניתן להשתמש כדי להעריך את היכולת של קולטני P2X7 כדי ליצור נקבוביות transmembrane. בעקבות היישום של אגוניסטים ATP (1 מ מ ATP), BzATP (100 μM) בקו ה-40 s (שמציין החץ), זמן לפתור cytometry זרימה לוכדת את אתידיום ברומיד הזנת התאים בזמן אמת (איור 3 א). אפקט זה היה הקלוש על ידי החומר המדכא ספציפי P2X7 AZ10606120. אתידיום ברומיד ספיגת וזמינותו מדגים קולטן P2X7 תפקודית קרבוקסילי17 , ראיות טובות לביטוי קולטן P2X7 באורך מלא. מבחני ריכוז-תגובה ATP להדגים את השפעת ריכוז אגוניסט על היווצרות נקבובית P2X7, באמצעות שינוי אתידיום ברומיד קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן (איור 3B). אגוניסט במינון עקומות הריכוז יחד עם מעכבי קולטן ספציפי לספק ראיות חזקות עבור הפעלת קולטן. איור 3: היווצרות נקבובית transmembrane P2X7 נמדדת אתידיום ספיגת. התוספת של אתידיום ברומיד רגעים לפני תחילת רכישת משמש למדידת להיווצרות נקבוביות transmembrane P2X7. ריכוזים גבוהים של התוצאה ATP ו- BzATP P2X7 (א) קולטן הנקבוביות היווצרות, ומאפשר אתידיום ברומיד להיכנס לתא. החומר המדכא P2X7 AZ10606120 נחלש תופעה זו, מספק ראיות על קולטני P2X7 תפקודית. מבחני ריכוז-תגובה (B) ATP הפגינו נקבובית משמעותית היווצרות μM 500, 1 מ מ אבל לא בריכוזים נמוכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. Phagocytosis מאת cytometry זרימה לחיות תאים הקבוצה שלנו הוכיחה בעבר כי חוץ-תאית ATP מעכב phagocytosis בתיווך P2X7 על ידי בריא את P2X7 קצה קרבוקסילי מ שלד התא, באופן ספציפי, nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן IIA18,19. שיטה זו מרחיב על ממצאים אלה כדי להדגים P2X7 קולטן מעורבות phagocytosis מאת בהיפוקמפוס, קדמון עצבית SVZ תאים בזמן אמת (איור 4, דוגמה של phagocytosis בהיפוקמפוס). חסרת מעצורים phagocytosis (בקרה) רמות של 1 מיקרומטר YG חרוזים לייטקס הוקמו הפקד חיובי. ATP עכבות של phagocytosis של חרוזים YG באותה מידה כמו מעכבי לא ספציפית, כלומר מחברים קיבוע ו- cytochalasin מעכב את פלמור אקטין D, ואילו 5% סרום ביטל phagocytosis מולדת כל20. איור 4: ספיגת חרוז YG הממחיש את יכולת phagocytic של אבות עצביים באמצעות קולטנים P2X7. YG ספיגת חרוז על ידי ובתאים עצבית הוא נצפות באמצעות תאים חיים flow cytometry בזמן אמת. רמות הבקרה של phagocytosis הוקם בתחילה, אם מספר התאים מאפשרת, שלו בסוף המרוץ. מעורבות של קולטני P2X7 מסומן על ידי עיכוב של phagocytosis בנוכחות ATP, כמו זה dissociates את קצה קרבוקסילי של שלד קרום התא, מניעת בתיווך P2X7 rearrangements cytoskeletal. היישום של ATP חסם phagocytosis באותה מידה כמו השימוש של מעכבי לא ספציפית של phagocytosis, כולל paraformaldehyde (PFA) ו- cytochalasin D (CytD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לניתוח של הפונקציה קולטן P2X7 בתרבויות תא עצבי קדמון הנגזר הגומחות neurogenic למבוגרים. יישומים אפשריים עבור מבוגרים קדמון עצבית תאים בטווח שבין מחקר למטרות טיפוליות, אז בטח השיטה של תרבות לשחזור ועמיד. ישנם מספר היבטים מרכזיים על פרוטוקול זה, אשר עשוי להשפיע האיכות של התרבות קצה. לאחר שהוסר הגולגולת, המוח אסור לייבוש, הקרע צריכה להתבצע מהר ככל האפשר. במיוחד עם ההיפוקמפוס, טיפול נוסף נלקח כדי להסיר את כל כלי הדם או רקמת עלי הלוואי קרומיים תגרום קדמון סופריור תא התשואות. דיסוציאציה את תהליך trituration בכבדות יכולים להשפיע מספר הספירות שהושג בתרבות; לזעזע את הרקמה במהלך הדגירה עם טריפסין-EDTA יביא פתרון הומוגני יותר. השימוש של זכוכית מלוטשים אש מרעה פיפטה מעל P1000 פיפטה פלסטיק עצה מומלץ להפחית את מות תאים ולשפר את התרבות הנוצרת. להימנע overtriturating. למרות הזהירות, ההליך יכול ליצור ייחוס בתרבות P0, כדי למנוע איבוד ובתאים, כביסה או להאכיל את התרבות להימנע, עד ספירות יצרו.

מספר הבדלים בין בהיפוקמפוס התרבויות SVZ יהיה ברור-P0. תרבויות בהיפוקמפוס תשואות הספירות פחות, אלה בדרך כלל ולהתבטא. השתמש טיפ פיפטה תמריא בעדינות את הכדורים למעבר הראשונית. הספירות חסיד לא נצפו קטעים עוקבות. סוגים שונים של תרביות רקמה מבחנות עלול לגרום את הספירות, ספירות בעיקר בהיפוקמפוס, לדבוק ולגדול כמו מושבות על החלק התחתון של המנה. זו לא נמצאה לשנות תוצאות במורד הזרם עבור פרוטוקול זה אך צריך לפקח, עקביות צריך להישמר במידת האפשר.

שיטות קודמות למדידת P2X7 קולטן בפונקציה, כגון תיקון מחבר חובק למעקה כדי להקליט זרם סידן, ההגדרה המפורטת הינם רק יכול לספק מידע על תא בודד. פרוטוקול זה מציג שיטה לשחזור מהיר כדי לנתח כל שלוש פונקציות עיקריות של קולטני P2X7 באמצעות מכונה אחת. Cytometry זרימה לחיות תאים זמן לפתור מאפשר לניתוח כל האוכלוסייה ומספק החוקר במידע קינטיקה של סידן זרם, היווצרות נקבובית, ו/או פונקציה phagocytic. בנוסף לכך, cytometry זרימה יכול בקלות לשמש כשיטה להערכת סמן ביטוי דפוסים וניתוח האוכלוסייה המבוסס על רמות ביטוי חלבון או גודל התא.

כאשר עורכים ניסויים אלה, הבדלים זרם מקסימלי סידן, ספיגת אתידיום או phagocytosis המחירים עלולים להיות שנצפו בין חזרה. כדי למזער את זה, גודל כדור, תרבות, ותנאים האכלה המשטר חייב להיות עקבי כמו הבריאות של התאים תהיה השפעה משמעותית על התוצאות המתקבלות. הפעם על הקרח גם יכולים להשפיע הנתונים, אז להבטיח הכל מוכן מראש כך הזמן על הקרח הוא מינימלי. ודא הסידן אינדקטור זמן טעינה עקבית. גורם נוסף שעשוי להוביל עקביות גדולה בהקלטות סידן המקסימלי הוא וריאציה בין אצוות ATP. הכנת המלאי ATP הוא קריטי, השימוש של קבוצות שונות עבור הניסויים אותו להימנע. מומלץ גם להשוות אצוות ישנים וחדשים כדי להבטיח שמ-ATP עולה בקנה אחד. היעילות של היריבים P2X7 עשוי גם להיות קו תא אצווה ותלוי, אז אופטימיזציה של דגירה פעמים וריכוזי ייתכן שתידרש.

ראוי לציין כי סידן זרם/בזרימת אחת מהפונקציות הסלולר מורכב ויסודי ביותר, יכול להיות מתווך על ידי קולטנים רבים. זרם ATP-induced סידן, כמו מידה קלאסי עבור הפונקציה P2X7 ערוץ/נקבובית, ייתכן אינן משקפות במדויק את הפונקציה האמיתית של רצפטורים P2X7, כמו ATP עשויה גם להפעיל את קולטני P2Y לשחרור סידן תאיים. במקרה זה, ייתכן בריום הקטיון יותר לשימוש במקום סידן כמו זרם שלה הוא חד כיווני16. כדי להבדיל את התרומה של רצפטורים P2Y סידן זרם, התנאים שבהם 1 מ”מ EDTA או אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, חומצה N′-tetraacetic (EGTA) מתווסף המדיום K+ במקום CaCl2 עשוי לשמש בזה וזמינותו.

פרוטוקול זה עשוי גם להיות להתאים בקלות כדי להתאים את סוגי תאים אחרים, יכול להיות שימושי עבור חוקרים את הפונקציונליות של קולטנים ערוץ חלופי יון או קולטני להשתתף phagocytosis. גם שעשוי להיות מותאם שיטה זו מכונה cytometry זרימה ללא מודול זמן. לדוגמה, מבחני phagocytosis ניתן לבצע איפה YG חרוזים מתווספים 7-8 דקות לפני הניתוח על ידי cytometry זרימה קונבנציונלי. לשמור את התאים ב 37 ° C, ללא הרף מערבולת אותם. זה לא יספק מידע בזמן אמת, אך הבדלים זריחה הסופי אומר עדיין יודיע החוקר לגבי הפונקציונליות של קולטני P2X7.

עניין P2X7 רצפטורים כמו תרופה כוון21,22 או גם משלוח סמים לנתב23,24 גדל במהירות, ולכן שיטות ללמוד קולטן חידתי זו חייב להיות ללא הרף הותאם ולשכלל כדי להקל על מחקרים אלה. פרוטוקול זה מתאר שיטות העשויות לשמש כדי לחקור את הפונקציה P2X7 ב ובתאים עצבית למבוגרים, יש לקוות כי השגת הבנה טובה יותר של הקולטנים P2X7 בתוך גומחות neurogenic עשוי להוביל החידושים בטיפול של שבץ מוחי, פציעה איסכמי אחרת.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות מריה Kasherman ווונג שין על תרומתם למחקר זה. עבודה זו נתמך על ידי מענקים מקרן רבקה ל’ קופר רפואי מחקר M.W. T.C.L., מ. ל, וכדי T.C.L. הלאומי לבריאות, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) של אוסטרליה (571100 ו- 1048082), (את קרן הצדקה בקסטר סידני, אוסטרליה). רגליים עקומות נתמכה על ידי המשפחה עתידה המועצה מחקר אוסטרלי (ARC) (FT120100581), NHMRC פרויקט מענקים (1048082, 1061419 ו 1120095), תשתית תפעולית תמיכה גרנט של הממשלה ויקטוריאני למכון Florey. מ. ל נתמכה על ידי צ’ארלס ד קלמן M.D. פוסט-דוקטורט פרס (2010) של קרן המחקר רשתית הבינלאומי (ארה”ב).

Materials

A438079 Tocris 2972/10
ATP Sigma-Aldrich A2383
AZ10606120 Tocris 3323/10
bzATP Sigma-Aldrich B6396
cytochalasin D Sigma-Aldrich C8273
FACSCalibur Becton Dickinson 
Fluo-8AM AAT-Bioquest 21080 Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully 
Fluoresbrite YG Microspheres  Polysciences Inc 17154-10 1.00 µm, yellow-green
Glutamine ThermoFisher Scientific 25030081 200 mM
HBSS ThermoFisher Scientific 14170112
heparin Sigma-Aldrich H3149
NeuroCult Basal Medium Stemcell Technologies 5700 Mouse and rat
NeuroCult Proliferation Supplement Stemcell Technologies 5701 Mouse and rat
oxidized ATP Sigma-Aldrich A6779
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 pluronic acid
Recombinant Murine EGF Peprotech 315-09
Recombinant Murine FGF-basic Peprotech 450-33
tetramethylammonium hydroxide Sigma-Aldrich T7505
Time Zero Module Cytek Biosciences
Tissue culture flasks BD Falcon (Corning) 353108 (T25), 353136 (T75) Blue vented screw cap
TrypLE Express Gibco 12604013
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientific 25200056 with phenol red
UltraPure Ethidium Bromide ThermoFisher Scientific 15585011 10 mg/mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Sperlagh, B., Illes, P. P2X7 receptor: an emerging target in central nervous system diseases. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (10), 537-547 (2014).
  2. Liang, X., et al. Quantifying Ca2+ current and permeability in ATP-gated P2X7 receptors. Journal of Biological Chemistry. 290 (12), 7930-7942 (2015).
  3. Rat, P., Olivier, E., Tanter, C., Wakx, A., Dutot, M. A fast and reproducible cell- and 96-well plate-based method for the evaluation of P2X7 receptor activation using YO-PRO-1 fluorescent dye. Journal of Biological Methods. 4 (1), 64 (2017).
  4. Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Journal of Quantitative Cell Science: Cytometry Part A. 85 (4), 313-321 (2014).
  5. Jursik, C., et al. A quantitative method for routine measurement of cell surface P2X7 receptor function in leucocyte subsets by two-colour time-resolved flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 67-77 (2007).
  6. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272 (5262), 735-738 (1996).
  7. Delarasse, C., et al. Neural progenitor cell death is induced by extracellular ATP via ligation of P2X7 receptor. Journal of Neurochemistry. 109 (3), 846-857 (2009).
  8. North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiological Reviews. 82 (4), 1013-1067 (2002).
  9. Leeson, H. C., et al. P2X7 Receptors Regulate Phagocytosis and Proliferation in Adult Hippocampal and SVZ Neural Progenitor Cells: Implications for Inflammation in Neurogenesis. Stem Cells. , (2018).
  10. Glaser, T., et al. Modulation of mouse embryonic stem cell proliferation and neural differentiation by the P2X7 receptor. PLoS One. 9 (5), e96281 (2014).
  11. Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
  12. Wiley, J. S., Gu, B. J. A new role for the P2X7 receptor: a scavenger receptor for bacteria and apoptotic cells in the absence of serum and extracellular ATP. Purinergic Signalling. 8 (3), 579-586 (2012).
  13. Lovelace, M. D., et al. P2X7 receptors mediate innate phagocytosis by human neural precursor cells and neuroblasts. Stem Cells. 33 (2), 526-541 (2015).
  14. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
  15. Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Frontiers in Neuroscience. 5, 89 (2011).
  16. Gu, B. J., Wiley, J. S. Broad applications of mulit-colour time-resolved flow cytometry. Flow Cytometry – Recent Perspectives. , (2012).
  17. Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J. C., Greenfeder, S. Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP channel. Biochemical and Biophysical Research Communications. 332 (1), 17-27 (2005).
  18. Gu, B. J., Saunders, B. M., Jursik, C., Wiley, J. S. The P2X7-nonmuscle myosin membrane complex regulates phagocytosis of nonopsonized particles and bacteria by a pathway attenuated by extracellular ATP. Blood. 115 (8), 1621-1631 (2010).
  19. Gu, B. J., Rathsam, C., Stokes, L., McGeachie, A. B., Wiley, J. S. Extracellular ATP dissociates nonmuscle myosin from P2X(7) complex: this dissociation regulates P2X(7) pore formation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 297 (2), C430-C439 (2009).
  20. Gu, B. J., et al. P2X7 receptor-mediated scavenger activity of mononuclear phagocytes toward non-opsonized particles and apoptotic cells is inhibited by serum glycoproteins but remains active in cerebrospinal fluid. Journal of Biological Chemistry. 287 (21), 17318-17330 (2012).
  21. Bhattacharya, A. Recent Advances in CNS P2X7 Physiology and Pharmacology: Focus on Neuropsychiatric Disorders. Frontiers in Pharmacology. 9 (30), (2018).
  22. Burnstock, G., Knight, G. E. The potential of P2X7 receptors as a therapeutic target, including inflammation and tumour progression. Purinergic Signalling. 14 (1), 1-18 (2018).
  23. Alves, L. A., et al. Pore forming channels as a drug delivery system for photodynamic therapy in cancer associated with nanoscintillators. Oncotarget. 9 (38), 25342-25354 (2018).
  24. Pacheco, P. A., et al. P2X7 receptor as a novel drug delivery system to increase the entrance of hydrophilic drugs into cells during photodynamic therapy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 48 (4), 397-411 (2016).

Tags

Real-time Live-cell Flow CytometryCalcium InfluxPore FormationPhagocytosisP2X7 ReceptorsNeural Progenitor CellsSubventricular ZoneHippocampusNeurospheresCell CultureCalcium Indicator DyeCalcium-free Sodium MediumPotassium Medium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Leeson, H. C., Chan-Ling, T., Lovelace, M. D., Brownlie, J. D., Weible II, M. W., Gu, B. J. Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (146), e59313, doi:10.3791/59313 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image