Измерение ферментативные стабильности путем изотермического титрования калориметрия
Summary
Термостабильность активность фермента измеряется легко изотермический титрования калориметрии (ЦМТ). Большинство анализов стабильности белка в настоящее время используется мера белка разворачивается, но не предоставляют информацию о ферментативной активности. ЦМТ позволяет прямое определение влияния фермента изменений на стабильность ферментативной активности.
Abstract
Эта работа демонстрирует новый метод измерения стабильности активность фермента, изотермические титрования калориметрии (ЦМТ). Пик жары скорость наблюдается после однократного введения раствора субстрата в решение фермента связан с ферментативной активности. Многократные инъекции субстрата в то же решение фермента с течением времени показывают потери активности ферментов. Автономное, требует очень мало времени, персонала и применима к большинству средств массовой информации и ферментов.
Introduction
Ферменты являются белки, способный катализировать широкий спектр органических реакций. Большинство ферментов функция в водном растворе в рядом с нейтральным pH, таким образом избегая использования суровых растворителей. Из-за их высокой селективностью, фермент катализатором реакции производят меньше (в некоторых случаях не субпродуктов) побочные продукты чем неизбирательной катализаторы например1кислот и щелочей. Это особенно актуально в производстве продовольствия, где все химические реакции должно быть сделано, чтобы конечный продукт является безопасным для потребления человеком. В настоящее время ферменты используются для производства Высокофруктозный кукурузный сироп2, сыр3, пиво4, лактозы молоко5и других важных пищевых продуктов. Хотя этот документ посвящен фермента использования в пищевой промышленности, есть много других применений для ферментов, в том числе в зеленой химии и наркотиков синтеза.
Полезность ферментов ограничен стабильности активность фермента, который зависит от поддержания трехмерной структуры фермента. Структура фермента может стабилизировать посредством модификации, такие как ПЭГилирование6, иммобилизации на прочную поддержку7, генетические модификации8и формулировок. В настоящее время фермент стабильность измеряется обычно дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и активность фермента конечной assays9. DSC измеряет температуру, при которой разворачивается фермент; чем выше температура, тем стабильнее структуры. Однако часто происходит потеря активности при более низкой температуре, чем требуется разворачиваться фермента или домены в пределах фермента10. Таким образом DSC не достаточно, чтобы определить ли модификация фермент увеличивает стабильность ферментативной активности. Assays энзима конечной точки, обычно время интенсивного, требуют несколько образцов и часто включают спаренных колориметрические реакции, которая не применима к высоко цветные или непрозрачные решения или суспензий.
Эта работа демонстрирует метод прямого измерения устойчивости активность фермента, изотермические титрования калориметрии (ЦМТ). ЦМТ измеряет скорость тепла освобождены или впитывается в ходе реакции. Поскольку почти все реакции производят или поглощать тепло, МТЦ может использоваться для большинства катализируемой ферментных реакций, включая реакции, которые не имеют спаренные реакции или происходят в непрозрачных носителей, таких как молоко. ЦМТ был использован на протяжении многих десятилетий для измерения химического кинетические параметры для многих видов реакций, но протокол, представленные здесь сосредоточена на использовании ЦМТ для измерения расхода тепла пик катализируемой ферментных реакций и демонстрирует, что активность фермента линейно коррелирует с расхода тепла пик. ЦМТ измерения пиковых ставок тепла в основном автономных и требуют очень мало времени персонала для установки и анализировать.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основным преимуществом пробирного стабильности фермента ЦМТ, описанные здесь является автоматизация. После того как сделаны все необходимые буферы и решения, время установки для каждого пробирного находится примерно 15 минут, для лица, совершающего assay. В отличие от обычных анализов дл…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Нет
Materials
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
Riferimenti
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, &. #. 3. 5. 0. ;. &. #. 2. 1. 4. ;., Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. . Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).
