Medir estabilidad enzimática por calorimetría isoterma de titulación
Summary
La estabilidad térmica de la actividad enzimática se mide fácilmente por calorimetría isoterma de titulación (ITC). Ensayos de estabilidad de la proteína la mayoría actualmente utilizan medir proteína despliegue, pero no proporcionan información sobre la actividad enzimática. CCI permite la determinación directa del efecto de las modificaciones de la enzima sobre la estabilidad de la actividad enzimática.
Abstract
Este trabajo demuestra un nuevo método para medir la estabilidad de la actividad enzimática por calorimetría isoterma de titulación (ITC). La tasa pico de calor observada después de una sola inyección de la solución sustrato en una solución de enzima se correlaciona con la actividad enzimática. Múltiples inyecciones de sustrato en la misma solución de enzima con el tiempo muestran la pérdida de actividad enzimática. El ensayo tiene carácter autónomo, que requiere muy poco tiempo de personal y es aplicable a la mayoría de los medios de comunicación y las enzimas.
Introduction
Las enzimas son proteínas capaces de catalizar una amplia variedad de reacciones orgánicas. Función de más enzimas en solución acuosa a cerca de pH neutro, evitando el uso de solventes agresivos. Debido a su alta selectividad, enzima catalizado reacciones producen menos (en algunos casos ningunos subproductos) subproductos de catalizadores no selectivos tales como ácidos y bases1. Esto es especialmente relevante en la fabricación de alimentos en todas las reacciones químicas deben hacerse para que el producto final es seguro para el consumo humano. Actualmente, se utilizan enzimas para producir jarabe de maíz de alta fructosa2,3de queso, cerveza4, leche sin lactosa5y otros productos alimentarios importantes. Aunque este trabajo se centra en el uso de enzimas en la industria de alimentos, hay muchos otros usos para las enzimas incluidas en síntesis química y de la droga verde.
La utilidad de las enzimas es limitada por la estabilidad de la actividad enzimática, que depende del mantenimiento de la estructura tridimensional de la enzima. La estructura de la enzima puede ser estabilizada por modificaciones como pegilación6, inmovilización en un soporte sólido7modificaciones genéticas8y formulaciones. En la actualidad, estabilidad de la enzima por lo general se mide por calorimetría diferencial de barrido (DSC) y ensayos de actividad enzimática de extremo9. DSC mide la temperatura a la que se desarrolla una enzima; a mayor temperatura, más estable la estructura. Sin embargo, la pérdida de actividad ocurre a menudo en una temperatura más baja que se requiere para desplegar la enzima o dominios dentro de la enzima10. Por lo tanto, DSC no es suficiente para determinar si una modificación de la enzima aumenta la estabilidad de la actividad enzimática. Análisis de enzima de extremo son generalmente intensivos en el tiempo, requieren de múltiples muestras y suelen implican una reacción colorimétrica juntada que no es aplicable a soluciones muy coloreadas u opacas o suspensiones.
Este trabajo muestra un método para la medición directa de la estabilidad de la actividad enzimática por calorimetría isoterma de titulación (ITC). CCI mide la tasa de calor liberado o absorbido durante el curso de una reacción. Puesto que casi todas las reacciones producen o absorben calor, ITC puede utilizarse para la mayoría de las reacciones catalizadas por enzima, incluyen reacciones que no tienen una reacción acoplada o se producen en medios opacos como la leche. ITC se ha utilizado por muchas décadas para medir parámetros cinéticos químicos para muchos tipos de reacciones, pero el protocolo que presentamos se centra en el uso de TIC para medir la tasa máxima de calor de las reacciones enzima-catalizadas y demuestra que la actividad enzimática es linealmente correlacionada con la tasa máxima de calor. ITC las medidas de tasas de máximo calor en su mayoría son autónomas y requieren de muy poco tiempo personal para configurar y analizar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una gran ventaja del análisis de estabilidad de enzima ITC descrito aquí es la automatización. Una vez todos los buffers adecuados y soluciones, el tiempo de cada ensayo es aproximadamente 15 minutos para la persona que realiza el ensayo. Por el contrario, los ensayos convencionales para la actividad de la invertasa y la lactasa requieren aproximadamente 2 horas con la participación continua de la persona que realiza el ensayo y muchos ensayos de actividad enzimática toman mucho más trabajo. En una publicación ant…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno
Materials
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
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