Misura di stabilità enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione
Summary
La stabilità termica dell’attività enzimatica è prontamente misurata tramite calorimetria isotermica di titolazione (ITC). La maggior parte delle analisi di stabilità di proteina attualmente utilizzato misura proteina sta svolgendo, ma non forniscono informazioni sull’attività enzimatica. ITC consente la determinazione diretta dell’effetto di modifiche di enzima sulla stabilità dell’attività enzimatica.
Abstract
Questo lavoro dimostra un nuovo metodo per misurare la stabilità dell’attività enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione (ITC). Il tasso di calore picco osservato dopo una singola iniezione di soluzione substrato in una soluzione di enzima è correlata con l’attività dell’enzima. Iniezioni multiple del substrato nella stessa soluzione enzima nel tempo mostrano la perdita di attività enzimatica. Il metodo è autonomo, che richiede pochissimo tempo personale ed è applicabile alla maggior parte dei media e degli enzimi.
Introduction
Gli enzimi sono proteine in grado di catalizzare una vasta gamma di reazioni organiche. La maggior parte funzione di enzimi in soluzione acquosa al vicino a pH neutro, evitando l’uso di solventi aggressivi. A causa della loro elevata selettività, enzima catalizzata reazioni producono meno (in alcuni non casi nessun sottoprodotti) sottoprodotti rispetto catalizzatori non selettivi come acidi e basi1. Questo è particolarmente rilevante nella produzione di cibo dove tutte le reazioni chimiche devono essere fatto così il prodotto finale è sicuro per il consumo umano. Attualmente, gli enzimi sono usati per produrre alta fruttosio sciroppo di mais2, formaggio3, birra4, privo di lattosio latte5e altri prodotti alimentari importanti. Mentre questa carta si concentra sull’uso degli enzimi nell’industria alimentare, ci sono molti altri usi per enzimi compreso nella sintesi chimica e droga verde.
L’utilità degli enzimi è limitata dalla stabilità dell’attività enzimatica, che dipende dal mantenimento della struttura tridimensionale dell’enzima. La struttura dell’enzima può essere stabilizzata tramite modifiche come PEGilazione6, immobilizzazione su un supporto solido7, modificazioni genetiche8e formulazioni. Attualmente, stabilità enzimatica è in genere misurata di calorimetria differenziale a scansione (DSC), e l’attività enzimatica endpoint saggi9. DSC misura la temperatura alla quale si dispiega un enzima; la temperatura è elevata, più stabile la struttura. Tuttavia, la perdita di attività si verifica spesso ad una temperatura inferiore rispetto a richiesta per spiegare l’enzima o domini all’interno degli enzimi10. Di conseguenza, DSC non è sufficiente per determinare se una modifica di enzima aumenta la stabilità dell’attività enzimatica. Analisi dell’enzima endpoint sono solitamente tempo intensivo, richiedono campioni multipli e spesso comportano una reazione colorimetrica accoppiata che non è applicabile a soluzioni altamente colorati o opachi o sospensioni.
Questo lavoro viene illustrato un metodo per la misura diretta della stabilità dell’attività dell’enzima tramite calorimetria isotermica di titolazione (ITC). ITC misura il tasso di calore rilasciato o assorbito nel corso di una reazione. Poiché quasi tutte le reazioni producono o assorbono calore, ITC può essere utilizzato per la maggior parte delle reazioni enzima-catalizzate, compreso le reazioni che non hanno una reazione accoppiata o verificarsi in mezzi opachi come il latte. ITC è stato utilizzato per molte decadi per misurare i parametri di cinetici chimici per molti tipi di reazioni, ma il protocollo qui presentato si concentra sull’utilizzo di ITC per misurare la velocità di picco di calore di reazioni enzima-catalizzate e dimostra che l’attività dell’enzima è linearmente correlato con il tasso di calore di picco. ITC misurazioni di velocità di picco di calore sono per lo più autonome e richiedono pochissimo tempo personale di installazione e analizzare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dei principali vantaggi dell’analisi di stabilità dell’enzima ITC descritto qui è l’automazione. Una volta che tutti i buffer appropriato e le soluzioni sono fatte, il tempo di set-up per ogni dosaggio è circa 15 min per la persona che fa il test. Al contrario, i dosaggi convenzionali per attività invertasi e lattasi richiedono circa 2 h con continuo coinvolgimento della persona facendo il test e molti saggi di attività enzimatica prendere considerevolmente più ore per persona. In una pubblicazione precedente, abbi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno
Materials
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
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